常见猪病PCR检测操作步骤及试剂配制一、RNA病毒（蓝耳病、猪瘟、乙脑、猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病 毒、轮状病毒等包括病料的处理、RNA的提取、反转录、和PCR扩增、凝胶电泳四个步骤1、 病料的处理取组织病料约2克，加入4-5毫升灭菌的PBS或者生理盐水，置研磨器（灭菌中研 磨或者用剪刀细心剪碎，置-20°C中反复冻融三次，即可用于检测2、 RNA的提取1取上述冻融三次的病料约 200微升置1.5毫升的离心管中，加入500-600微升 TRIzol剧烈振摇30秒后，静置5分钟后，再次剧烈振摇30秒后，静置5分钟2在加入200微升的氯仿,上下颠倒混匀30s，静置5分钟,4C 12000g离心15 min离心完毕后，取上清约 400-500微升（注意不要吸到中间层白色物质置新的灭菌 好的离心管中，加入等体积的异丙醇，颠倒数次后（不可剧烈震动静置10分 钟,4C12000g离心10 min.可见管底部有少量白色沉淀，倒掉异丙醇，加入1毫升75% 的乙醇（DEPC水配制，振摇，将白色沉淀悬浮,4C7500g离心5 min弃去上清,干燥沉 淀物（将离心管倒置于卫生纸或者其它吸水纸上,室温约5 min即可加入20yLDEPC 水溶解用于RT-PCR，或于-20C保存备用。
两步法:1、反转录在10吐的反转录体系中加入:上述步骤中提取的RNA7yL、5xBuffer 2吐、0.5吐或者下游引物 O.5yL;65C10 分钟，10 mM dNTP 0.25吐、Oligo （dT18迅速放置-20摄氏度冰箱中2分钟，加入M-MLV lOOU/吐 0.25吐（反转录酶 37°C水浴lh,即可做为PCR扩增的模板，立即用于PCR扩增或置于-20 °C保存备 用2、PCR 扩增设立阳性和阴性对照,阳性对照一般为病毒液,阴性对照用灭菌的双蒸水做为 PCR反应模板反应总体系为25yLcDNA 2吐,（模板25mmol/L Mg2+ 1.5吐，2.5mmol/L dNTPs 2.0yL,10x Mg2+ free PCR Buffer 2.5吐，20mmol/ L上下游引物各1吐，Taq DNA 聚合酶（5U/yL0.2yL无菌双蒸水补至25.0yLPCR反应条件为:94C预变性3 min;94°C 45s,56°C 45s,72°C 45s，共进行36个循 环;最后72C延伸10min根据不同的病毒设定时间和温度一步法:采用的是 TaKaRa 的 PrimeScript One Step RT-PCR Kit Ver.2 试剂盒在 25uL反应总体系：<1> PrimeScript 1 Step Enzyme Mix , 1uLv2> 2 x 1 Step Buffer , 12.5uLO ,6.5ul<3> RNase Free dH2<4> 20mmol/ L上下游引物各lyL,<5>提取的RNA模板:3ul反应条件:50°C反转录30min,94°C预变性2min,进行30个循环（94°C变性1min, 56°C退火1min,72°C延伸1min,最后72C延伸10min。
扩增完的PCR产物放4°C保 存3、 凝胶电泳1%琼脂糖凝胶的配制0.25琼脂糖+25毫升TAE+1.25微升Goidview放入锥形瓶中，置烤箱中约1分 钟沸腾后,摇匀,放置室外,约20-30分钟后倒入板中,约30-45分钟凝固后即可使用 点样:将凝胶放入电泳槽中,DL2000的DNA Marker3-5微升，其它样品5微升+0.5-1 微升的londingbuffer混合后点样，开启电泳仪，电压80-150V4、 PCR 产物回收纯化取20吐PCR产物与4吐6xLoading Buffer混匀,1%琼脂糖凝胶（GoldView 0.5ug/ml电泳电泳结束后，在紫外灯下切出含有目的DNA条带的琼脂糖凝胶，用纸 巾吸尽凝胶表面的电泳缓冲液，此时应注意尽量切除不含目的DNA部分的多余凝胶 以减小凝胶体积，从而提高DNA的回收产率之后按照胶回收试剂盒产品说明书回 收目的片段，并取lyL回收产物点样观察回收效果纯化步骤如下:(1称量胶块重量，计算胶块体积，按照1mg等于1”!计算胶块体积;(2 向胶块中加入 3倍胶块体积的融化液 DR-I Buffer;(3均匀混合后65°C水浴10 min,其间摇晃3-5次使胶块完全溶化；(4向上述胶块融化液中加入DR-I Buffer 0.5倍体积量的DR-II Buffer,均匀混合;(5转移液体至Spin column中,12,000 rpm离心lmin,弃滤液(可将滤出液体回收 再离心一次以提高DNA回收率；(6 将 500ul 的 RinseA 加入 Spin column 中,12,000 rpm 离心 30s，弃滤液；(7 将 700 ul 的 Rinse B 加入 Spin column 中，静置 2-3 min,12,000 rpm 离心 30s，弃 滤液;(8 重复上一步操作;(9 10,000 rpm，离心 1min,弃滤液；(10将Spin column安置于一灭菌的1.5ml Eppendorf管中,在滤膜中央处加入灭 菌双蒸水或者试剂盒中的洗脱缓冲液20-30微升,室温静置1-2 min； (11 12,000 rpm 离心1min,收集滤出液体再离心洗脱一次,即得到纯化的PCR产物。
注:PCR纯化产物可直接用于测序，如用PCR回收产物直接测序时，回收第10步 中不可用洗脱缓冲液,只可用双蒸水5、DNA病毒(PCV2、伪狂犬病毒、细小病毒等包括病料处理、DNA的提取和PCR扩增、凝胶电泳四个步骤1 、病料处理同上2、DNA的提取1 取处理好的病料约 1 毫升置 1.5 毫升的离心管中 ,12000 rpm/min 离心五分钟，取上清液（500-700^1 .缴入等体积的氯仿剧烈振摇静止5分钟,12000 rpm离心10分钟,2去上清至新的离心管中,加入终浓度为分别为10%的SDS（约50微升和50yg/m1蛋白酶K（约10微升,55°C作用1.5h-2h（提前准备好水浴锅3加入200uL Tris饱和酚，振荡混匀,4C,12000 rpm/min离心15min;4取上清液,于一个新的离心管中，加入Tris饱和酚和氯仿各200uL，充分混匀，12000 rpm/min 离心 15min;5取上清于一新的离心管中，加入200uL氯仿，充分混匀,12000 rpm/min离心 15min;6去上清于新的离心管中，加入2倍体积无水乙醇,-20C放置20min, 12000rpm/min离心15min,弃上清。
无水乙醇提前冰浴7加入70%的乙醇（提前放入冰箱冲洗沉淀表面和管壁,弃乙醇,晾干 （若无沉淀可以离心7500 rpm/min离心5min;8最后加入20卩1无菌ddH2O溶解,-20C保存备用3、PCR 扩增设立阳性和阴性对照,阳性对照一般为病毒液,阴性对照用灭菌的双蒸水做为PCR 反应模板反应总体系为25yLcDNA 2吐,（模板25mmol/L Mg2+ 1.5yL,2.5mmol/L dNTPs 2.0yL,10x Mg2+ free PCR Buffer 2.5吐，20mmol/ L上下游引物各1吐，Taq DNA 聚合酶（5U/yL0.2yL无菌双蒸水补至25.0yLPCR反应条件为:94°C预变性3 min;94°C 45s,56°C 45s,72°C 45s，共进行36个循 环;最后72C延伸lOmin根据不同的病毒设定时间和温度3、 凝胶电泳同上4、 PCR产物的纯化回收以及测序同上试剂配制1、 DEPC 水的配制向灭菌的玻璃瓶中加入超纯水，然后加入DEPC至终浓度为0.01%（V/V过夜搅 拌（放置摇床中,高压灭菌即可2、 病料处理用PBS的配制NaCl: 8.OOgKCl: O.2OgNa2HPO41.42 gKH2PO4:0.27g向烧杯中加入800毫升去离子水，充分搅拌,用浓盐酸调节PH至7.4,加入去离子 水定容至 1 升,高压灭菌后即可使用。
1、TAE 电泳液150XTAE 贮存液:Tris242g，冰乙酸 28.5 ml 和 Na2EDTA.2H2O 37.2混合,向烧杯中加入 800 毫升去离子水,充分搅拌,加入 57.1 毫升醋酸,充分搅拌,加入去 离子水定容至 1 升,室温保存21xTAE工作液:50xTAE贮存液20 ml,加纯水定容至1000 ml4、10%SDS:10gSDS置于100-200ml烧杯中，加入80ml的去离子水,68°C溶解， 调PH7.2，早定容100ml.5、dNTP Mixture、ExTaqDNA 聚合酶、TRIZOL 等试剂均购自 Invitrogen 公司; M-MLV 购自 Promega 公司DL2000 的 DNA Marker , 一步法的 PrimeScript One Step RT-PCR Kit Ver.2 试剂盒购自TaKaRa公司Tris饱和酚，购自Solarbio检测用的引物:1.蓝耳:上游:JN1 5 CGGTTTTGATGGGCGACA 3下游:JN2 5 TGCAGGCGTGCGAGGTAA 3退火温度:53-56°C检测缺失毒株用2.猪瘟<1>检测疫苗毒用上游:HCV1 5AAACGGAGGGACTAGCCGT 3下游:HCV2 5GATTCAACTCCATGTGCCATG3退火温度:56 C<2>检测野毒上游:CSFV1 5-ACCTAATCTTACACTATGCAATC-3下游:CSFV2 5-CTGGACTAGTCCCATCAAAT-3退火温度:51-54 C3.传染性胃肠炎上游:TGEV1 5-GATGGCGACCAGATAGAAGT-3下游:TGEV2 5-GCAATAGGGTTGCTTGTACC-3退火温度:51 °C4.流行性腹泻上游:PEDV1 5- GAAATAACCAGGGTCGTGGA-3下游:PEDV2 5-GCTCACGAACAGCCACATTA-3退火温度:51 C5. 乙脑上游 JE -1 5 AACAGCATGCAAATCGAAGAC3下游 JE- 2 5 CCAGAAACATCACCAGAAGG3退火温度:55 C6. 伪狂犬上游:PRV-gB-F 5'CGTCGAAGTACACGTACCCG3'下游:PRV-gB-R 5'CTCGAGCGAGCTGCAGAACAAG3'退火温度:55 C7.细小上游:PPV-F 5'CCCAGAGGCAACAGCAATTAGG 3'下游:PPV-R5'CGAGATCTTGTGAAGATGTGG3'退火温度 55C8.圆环上游:PCV2-F 5'CAACAGCATGCCCAGCAAGAAGAAT3'下游:PCV2-R5'TAGATTACACAGTCTCAGTAG3'退火温度55 °C。