真菌 基因工程 三、 酵母表达系统 二、 酵母转化系统 一、真菌表达系统的优缺点 四、丝状真菌表达系统 三 酵母表达系统 甲醇酵母表达系统 酿酒酵母表达系统 其它酵母表达系统 （一） 酿酒 酵母表达系统 酿酒酵母分泌系统 酿酒酵母系统启动子 酿酒酵母表达系统存在的问题 酿酒酵母糖基化系统 1、酿酒酵母启动子 UAS URS TATA 起始 位点 编码序列 mRNA 40-120bp 20-40bp 100-1400bp 1、转录起始位点； 4、 URS： 上游阻遏序列 2、 TATA盒： 富含 AT； 5、 DAS： 下游激活序列 3、 UAS： 上游激活序列 ; DAS 1）糖酵解途径中关键酶的强启动子，受葡萄糖诱导： 甘油醛 -3-磷酸脱氢酶基因 GAPDH 磷酸甘油激酶基因 PKG 乙醇脱氢酶基因 ADH 酿酒酵母表达系统常用启动子 2）半乳糖激酶启动子（ GAL1） GAL1 GAL7 GAL10 UAS GAL4 GAL80 A、 GAL1、 GAL7和 GAL10基因连锁在一起，独立转录，共同调控 B、 GAL4产物与 UAS结合，促进转录； GAL80产物抑制 GAL4产物的活性，阻遏转录 C、野生型 GAL4表达水平低，产物活性可被 GLAL80产物完全抑制，半乳糖诱导效果差 半乳糖诱导、葡萄糖抑制 2）半乳糖激酶启动子（ GAL1） GAL1 GAL7 GAL10 UAS GAL4 GAL80 A、 将 GAL4的启动子换成 GAL10的诱导型强启动子 B、半乳糖诱导 GAL4高表达，不受 GAL80产物抑制，激活 GAL1等高效转录 半乳糖诱导、葡萄糖抑制 Promoter GAL10 3） pho4TS-PHO5启动子 A、 PHO5启动子在培养基缺磷酸盐时启动转录 B、 PHO4基因编码产物是 PHO5启动子的正调控因子 C、 pho4TS 温度敏感， 35 时失活， PHO5关闭 D、 pho4TS-PHO5启动子通过 降温（ 23 ） 诱导表达 低温诱导、磷酸盐抑制 酿酒酵母系统常用分泌信号肽来源： 性结合因子： MF- 酸性磷酸酯酶： PHO5 蔗糖酶： SUC2 杀手毒素因子： KIL 2、酿酒酵母分泌系统 *保守性低，大多异源宿主系统的信号肽不能互用 *信号肽结构： 酿酒酵母 信号肽特点 正电荷区 疏水区 极性区 Met 目的蛋白 信号肽剪切位点 *分泌效率高 *在酵母系统具有通用性 *88个残基组成 MF-信号肽 Met 目的蛋白 -Lys-Arg-Glu-Ala-Glu-Ala- KEX2 DAP DAP DAP： STE13编码的二肽酶 糖基化位点： Asn-X-Thr/Ser（ X代表任何氨基酸） N-型糖基化： 天门冬酰氨酸 残基上的 酰胺氮 进行糖 基化，对蛋白质的折叠、稳定性及活性较重要。
O-型糖基化： 苏氨酸 /丝氨酸 上的 羟基氧 进行糖基化 3、酿酒酵母糖基化系统 * 过糖基化（超糖基化修饰）： N型或 O型糖基的外链进一步形成庞大的、由甘露糖 组成的、复杂分支结构的现象增加了免疫原性、对活 性与药代稳定性均有影响 *糖链组成 O型糖链仅由甘露糖组成、而哺乳细胞的还含唾液酸 基团 酿酒酵母糖基化特点 1）表达水平普遍不高 A、表达载体传代不稳定（ YEp、 YRp） B、所采用的强启动子调控不严谨 C、不能利用简单的无机培养基进行高密度发酵 2）分泌表达产物过糖基化 4、酿酒酵母表达系统的缺陷 （二） 甲醇 酵母表达系统 甲醇酵母与甲醇氧化酶启动子 甲醇酵母表达系统的应用 甲醇酵母表达系统操作原理 甲醇酵母系统高效表达影响因素与对策 甲醇酵母表达系统的优缺点 1、甲醇 酵母与甲醇氧化酶启动子 甲醇酵母 （ methylotrophic yeast) 指可利用甲醇作单一碳源的一类酵母 毕赤酵母 （ Pichia pastoris) 汉森酵母 （ Hansenula ploymorpha) 假丝酵母 （ Candia boidinii) 1、甲醇 酵母与甲醇氧化酶启动子 甲醇氧化酶 A、甲醇代谢关键酶，占可溶蛋白的 30%以上 B、名称和拷贝数不同 毕赤酵母 /假丝酵母 汉森酵母 醇氧化酶 甲醇氧化酶 alcohol oxidase,AOX methanol oxidase,MOX AOX1、 AOX2 MOX 1、甲醇 酵母与甲醇氧化酶启动子 AOX1与 AOX2 *毕赤酵母和假丝酵母基因组存在二个 AOX基因 AOX1、 AOX2 *AOX1与 AOX2基因 97%同源 *AOX1 占主导地位，负责 AOX 99%以上活性 1、甲醇 酵母与甲醇氧化酶启动子 甲醇氧化酶启动子 A、目前已发现的、最强的真核启动子 B、严谨调控型启动子 AOX1：葡萄糖和甘油脱阻遏、甲醇诱导 MOX：葡萄糖阻遏、甘油脱阻遏、甲醇诱导 2、甲醇 酵母表达系统的优缺点 A、表达水平高（最高水平的系统） B、产物可翻译后修饰：糖基化、磷酸化、酰脂化 C、过糖基化程度比酿酒酵母少（ 8-15个 vs100-150 个甘露糖） D、产物可正确折叠和高效分泌（最高分泌表达系统） E、可利用简单无机盐培养基高密度发酵，生物量大。
F、实验室和工业操作简单 G、不能满足结构要求严格的糖基化 3、甲醇 酵母表达系统操作原理 宿主株与标记基因 甲醇酵母系统的整合事件 胞内表达与分泌表达 甲醇 酵母系统宿主 二大宿主系统主要特点 项目 毕赤酵母 汉森酵母 最适温度 30 37 最适 pH值 4.5 4.5 甘油阻遏 是 否 糖基化 部分过度 较正常 高密度发酵 100g/L 100g/L 甲醇 酵母系统宿主 二大宿主系统主要选择标记 宿主 选择标记 毕赤酵母 his4、 G418、 Zeocin、 Cu+ 汉森酵母 leu2、 his3 、 ura3、 G418 甲醇 酵母系统宿主 毕赤酵母系统 主要宿主株 宿主株 特点 Y11430 野生型、 Mut+ GS115 his4- 、 Mut+ KM71 his4-、 aox1:ARG4 (AOX1-)、 Muts SMD1168 his4- 、胞外蛋白酶缺陷，高分泌 MC1003 his4-、 AOX1-、 AOX2-，甲醇不生长 甲醇 酵母系统的整合事件 YRp型载体： 汉森系统 传代不稳定，传代过程同源或非同源重组，高选择 压力迫使高拷贝数整合，可达 100拷贝 YIp型载体： A、在靶序列处线性化载体 DNA，诱导同源重组 B、有“插入”和“取代”二类整合模式 C、主要为单拷贝整合， 1-10%为多拷贝整合 毕赤 酵母系统模式表达载体 1） AOX1位点插入 宿主株 :GS115、 KM71 可插入位点： 5AOX1 3AOX1 TT 转化子： GS115:His+Mut+ KM71:His+Muts 2） His4位点插入 转化子： GS115:His+Mut+ KM71:His+Muts 宿主株 :GS115、 KM71 可插入位点： 5His4 3His4 3） 多基因插入事件（串联整合） 宿主株 :GS115、 KM71 可插入位点： 5AOX1 3AOX1 TT 转化子： GS115:His+Mut+ KM71:His+Muts 4） 基因取代（ GS115， AOX1+） 转化子： His4+Muts 汉森酵母系统的高拷贝整合型表达载体 高拷贝整合元件： A、高度重复序列： rDNA 提供多个整合位点 B、缺陷型标记基因： Leu2d 提高选择压力 C、抗性标记； neo 提高选择压力 甲醇 酵母系统胞内表达载体 表达载体类型 需要带入 ATG 单位点 甲醇 酵母系统胞内表达载体 表达载体类型 需要带入 ATG 多位点 甲醇 酵母系统分泌表达载体 信号肽： PHO1 甲醇 酵母系统分泌表达载体 信号肽： MF 甲醇 酵母系统分泌表达载体 信号肽： MF 标记： Kan 4、甲醇 酵母系统高效表达影响因素与对策 载体稳定性 基因剂量 整合位点 甲醇利用表型 mRNA5端 AT含量分泌信号 表达产物稳定性 1）载体稳定性 同拷贝数时，整合型的比自主复制型的表达水平高 YRp型载体的稳定化： 选择 非选择培养交替数十代可得稳定的整合子 ，但费时，整合位点不确定。
采用 YIp型载体 : 更易实现整合、整合位点清楚 2）基因剂量 外源基因表达存在基因剂量效应 筛选多拷贝整合子 载体引入 G418/Zeocin抗性标记，整合子拷贝数 与抗性成正相关，采用高 G418/Zeocin抗性转化子 体外串联多个表达盒，直接获多拷贝整合子 采用 YRp型载体稳定化技术获高拷贝整合子 构建高拷贝整合型表达载体 3）整合位点 外源基因表达盒整合于 AOX/MOX或标记基因处，均 可高效表达 毕赤酵母中个别情况整合于 His4位点的比 AOX1位点 的低 4）甲醇利用表型 在分泌表达情况下，甲醇慢生长型更利于表达 5） mRNA5端 mRNA5端非翻译区（ UTR）的组成与长度 应尽量与 AOX1/MOX的一致 应尽量避免在 UTR区出现 AUG和次级结构 6）基因序列的 AT含量 AT含量越高、越容易出现类似于终止子的结构 7）分泌信号 分泌表达效率与所用分泌信号高度相关 可采用酿酒酵母来源的 MF、 PHO或 SUC等的信号 肽，或野生型信号肽，但适用性要比较分析 8）表达产物稳定性 分泌表达时，胞外蛋白酶是要影响因素 降低培养基 pH值：蛋白酶在酸性条件下活性较低 培养基中添加蛋白水解产物：竞争性抑制 采用蛋白酶缺陷宿主株：如 P.pastoris SMD1168 。