双向电泳 辉骏生物：辉骏生物：http:/ 辉骏生物：辉骏生物：http:/ 辉骏生物：辉骏生物：http:/ electrophoresis)的基本原理是基于蛋白质的等电点（pI)和分子量(Mr)不同而分离蛋白质：第一向电泳等电聚焦（Isoelectric Focusing，IEF）根据蛋白质的等电点不同将蛋白质分离，第二向电泳十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis,SDSPAGE）利用蛋白质的分子量大小不同将蛋白质分离双向电泳一次可以从细胞、组织或其它生物样本中分离上千种蛋白质，凝胶上的斑点都对应着样品中的蛋白质，且各种蛋白质的等电点，分子量和含量的信息都能通过质谱鉴定和软件分析获得因此其在蛋白质组分析、疾病标志物检测、细胞差异分析、药物开发、癌症研究等领域都得到了广泛的应用辉骏生物：辉骏生物：http:/ (2)：蛋白质溶解以及破坏蛋白质与蛋白质分子之间，蛋白质与 非蛋白质之间的共价与非共价相互作用2:2:蛋白质制备主要遵循的原则：蛋白质制备主要遵循的原则：(1)：尽可能溶解全部蛋白质，打断蛋白质之间的共价结合，使 蛋白质以分离的多肽形式存在。
2)：避免蛋白质的修饰作用与蛋白质的降解作用3)：避免脂类、核酸、盐等物质的干扰作用4):去除高丰度蛋白对低分度蛋白的掩盖作用5):防止样品在聚焦时发生蛋白质的聚集和沉淀6)：蛋白质样品与第一向电泳的相容性二、双向电泳样本制备二、双向电泳样本制备 辉骏生物：辉骏生物：http:/ （1 1）将组织切细后置于研钵中，迅速加入液氮进行研磨，直至组织变成粉末，均匀而没有明显颗粒即可2 2）在研钵中加入800LB（使用前加入1 PMSF），充分溶解（收集）粉末后转移至1.5mLEP管中，4，12000r/min，离心20min，收集上清液3 3）超声处理，破碎核酸每个EP管超声3次，每次58下，然后进行离心，4，12000r/min，离心20min，收集上清液4 4）将上清液分装成3管，每管约250L，每管再加入1mL丙酮-20沉淀过夜沉淀完的蛋白质于4，12000r/min，离心20min，倒去上清液后，平放于干净的纸巾上自然干燥，即可得到处理后的蛋白质团块，-80保存备用5)(5)在干燥后的蛋白质团块中加入相应量的RB（具体加入量视蛋白团块大小而定），用枪头将蛋白质团块戳小后反复吹打直至蛋白质完全溶解。
对于太过干燥的蛋白质团块（呈透明状），可用50L移液器调至10L刻度处，吸上一点RB封住枪头，然后反复的将蛋白质团块戳小，再用超声仪处理，直至看不到明显的蛋白质团块为止4，12000r/min，离心20min，吸出上清液，转移至新的EP管中辉骏生物：辉骏生物：http:/ （1 1）植物样本置于研钵中，迅速加入液氮进行研磨，直至组织变成粉末，均匀而没有明显颗粒即可，在研钵中加入一小勺PVPP（用于吸附植物组织破碎后释放出的酚类物质），用药勺将粉末转移至50mL离心管中2 2）在50mL离心管中加入8mL提取液混匀，再加入8mLTris饱和酚，充分振荡后放置于冰上，每隔5min振荡一次，总共6次，45000r/min，离30min，此时溶液会分层，下层为水相，上层为酚相，吸出上层液体，转移到15mL离心管中3 3）加入与酚相同体积的提取液，充分振荡后放置于冰上，每隔5min振荡一次，总共6次，4，5000r/min，离心30min，吸出上层酚相，转移至新的15mL离心管中重复一次苯酚抽提4 4）加入最后得到的酚的5倍体积的醋酸铵甲醇溶液对蛋白进行沉淀，充分振荡后置于冰上保温每隔5min振荡一次，总共6次，于-20沉淀过夜。
5 5）对沉淀过夜的蛋白质4，5000r/min，离心30min，倒掉上清液，加入5mL甲醇对蛋白进行洗涤，反复吹打均匀后，4，5000r/min，离心30min重复一次辉骏生物：辉骏生物：http:/ 6）加入4mL丙酮对蛋白进行洗涤，反复吹打均匀后，4，5000r/min，离心30min重复一次操作加入3mL丙酮，吹打均匀后将蛋白质平均分到3支1.5mLEP管中，4，12000r/min，离心20min倒去上清液后，平放于干净的纸巾上自然干燥，即可得到处理后的蛋白质团块，-80保存备用7)(7)在干燥后的蛋白质团块中加入相应量的RB（具体加入量视蛋白团块大小而定），用枪头将蛋白质团块戳小后反复吹打直至蛋白质完全溶解对于太过干燥的蛋白质团块（呈透明状），可用50L移液器调至10L刻度处，吸上一点RB封住枪头，然后反复的将蛋白质团块戳小，再用超声仪处理，直至看不到明显的蛋白质团块为止4，12000r/min，离心20min，吸出上清液，转移至新的EP管中二、双向电泳样本制备二、双向电泳样本制备植物样本植物样本rehydration buffer stock(RB)rehydration buffer stock(RB)ReagentReagentFinal concentrationFinal concentrationUrea(FW 60.06)7MThiourea(FW 76.12)2MCHAPs(FW614.89)4%(W/V)辉骏生物：辉骏生物：http:/ buffer(LB)ReagentReagentFinal concentrationFinal concentrationTris20mMThiourea(FW 76.12)2MUrea(FW 60.06)7MCHAPs(FW 64.89)2%(W/V)Phenol extraction bufferReagentReagentFinal concentrationFinal concentrationSucrose(FM 342.30）0.7MKCl（FM 74.55）0.1MEDTA（FM 292.25）50mMTris（FM 121.14）0.5MHClTo pH7.5醋酸铵甲醇溶液醋酸铵甲醇溶液Ammonium acetate in methanolAmmonium acetate in methanol用甲醇配制0.1M的醋酸铵二、双向电泳样本制备二、双向电泳样本制备 辉骏生物：辉骏生物：http:/ Buffer、1溴酚蓝、RB调制最终体积至460L。
将样品溶液混合均匀后，4 12000r/min，离心20min，吸取上清液450L进行泡胀3：取出水化盘，在底下铺上白色纸巾（方便观察胶条泡胀情况），调节水平备用从冰箱取出干胶条复温（如不复温胶条会吸潮）吸取离心后的样品上清液加到水化盘的槽中，450L样液可分3枪加入，第一二枪每枪吸160L，从槽顶端开始，沿左右边缘加入，将样液加成一条细线，长约22cm，第三枪吸至管中样液剩余20L左右即可，加至槽的顶端，将顶端部分覆盖满调节室内温度为20，让胶条泡胀过夜（1012h），4：等点聚焦（IEF),等电聚焦程序为：S1 stp 300V 20min,S2 stp 700V 30min,S3 stp 1500V 1.3h,S4 grd 9900V 3h,S5 stp 9990V 5.3Hr,S6 stp 600V 20h5：跑完等电聚焦以后，取出胶条，吸干表面的覆盖油，胶面朝上将胶条放入平衡管中，胶条应置于-20保存如果需要运输，则要用冰完全包埋平衡管保温辉骏生物：辉骏生物：http:/ 1：作用：作用 DDT与IAA联合使用，还原蛋白质的巯基，SDS使蛋白质带上负电荷以利于第二向SDS-PAGE电泳。
2 2：实验步骤：实验步骤 （1）：取出放置有胶条的平衡管，每管加入10mL左右去离子水洗掉胶条表面的覆盖油，去掉去离子水2）：SDS平衡液加入100mM DTT混匀后，每支平衡管加入8mL平衡液进行平衡15min，去掉平衡液3）：SDS平衡液加入250mM IAA混匀后，每支平衡管加入8mL平衡液进行平衡15min，去掉平衡液4）SDS 平衡液：50mM Tris-HCl(pH8.8)，6M Urea(FW 60.06)，30%(v/v)Glycerol(87%v/v)，2%(w/v)SDS(FW 288.38)，0.002%(w/v)Bromophenol blue注：在进行IPG胶条平衡前，第二向凝胶必须准备好 辉骏生物：辉骏生物：http:/ 1、根据实验分离片段大小选择不同浓度的、根据实验分离片段大小选择不同浓度的PAGEPAGE胶：胶：2 2、配制、配制12.5%SDS-PAGE12.5%SDS-PAGE凝胶：凝胶：ReagentsReagentsVolumn of reagentsVolumn of reagents123456Monomer solution50.04 ml75.06 ml100.08 ml125.1 ml150.12 ml175.14 ml4 resolving gel buffer30ml45 ml60 ml75 ml90 ml105 ml10%SDS1.2ml1.8 ml2.4 ml3.0 ml3.6 ml4.2 mlDouble distilled water38.16ml57.24 ml76.32 ml95.4 ml114.48 ml133.56 ml10%ammonium persulfate600l900 l1.2 ml1500 l1800 l2.1 ml五、第二向电泳五、第二向电泳SDS-PAGESDS-PAGE电泳电泳30%T,2.6%C Monomer stock solution：ReagentReagentFinal concentrationFinal concentrationAcylamide(FW 71.08)30%N,N-methylenebisacrylamide(FW 154.17)0.8%0.2m膜过滤，4保存4 4 Resolving gel buffer Resolving gel buffer：ReagentReagentFinal concentrationFinal concentrationTris-base(FW 121.1)1.5MHCl(FW 36.46)To pH8.8 0.2m膜过滤，4保存10%SDS：ReagentReagentFinal concentrationFinal concentrationSDS(FW 288.38)10%0.2m膜过滤，室温保存 辉骏生物：辉骏生物：http:/ 3 3、灌胶：灌胶：灌胶时使胶液沿着灌胶口斜面的厚塑料垫板流下，动作均匀，灌至液面到灌胶口平为止。
迅速在胶面上加入水饱和正丁醇压平液面，加入时使枪头贴着玻璃长板缓慢划动均匀加入，当所有玻璃板加完2mL后，在玻璃板和灌胶器的缝隙处也各加入2mL使内外液面相平，然后再加正丁醇至没过短板为止蒙上保鲜膜过夜辉骏生物：辉骏生物：http:/ 4:4:电泳电泳 （1）用1x电泳缓冲液配制1%的低熔点琼脂糖45mL，1%的普通琼脂糖80mL，加入溴酚蓝溶液至1X后放于泡沫盒中备用，吸取低熔琼脂糖封住SDS-PAGE整个胶面迅速从平衡管中取出胶条，在装上槽液的量筒中稍微涮洗一下，将胶条放入玻璃板中，酸性端朝左放置，用尺子把胶条压到二向胶胶面处，使胶条下端紧密接触二向胶胶面，注意不要让胶条下端困住气泡2）依次放好胶条后将玻璃板装入下槽中，装玻璃板时可倾斜放入，避免玻璃板下端产生气泡装好玻璃板后装上槽，然后在槽与玻璃板的缝隙处加入1%普通琼脂糖封住缝隙防止垂直方向上漏电在上槽中轻轻地加入上槽液（2 x 电泳缓冲液）至最大刻度处，用上槽液稀释一倍配置成下槽液（1 x 电泳缓冲液），加入到下槽中直到上下槽液面相平，盖上盖子，接上电极后开始电泳电泳条件为，2W/gel 45min后改为17W/gel继续电泳，当BPB跑出二向胶以后可停止电泳。
10 SDS 电泳缓冲液，1%SDS，250mM Tris-base，1.92M Glycine300 X 溴酚蓝储存液，1%溴酚蓝，50mM Tris-base五、第二向电泳五、第二向电泳SDS-PAGESDS-PAGE电泳电泳 辉骏生物：辉骏生物：http:/ 1、考染：、考染：（1）电泳结束后，用塑料尺子将玻璃板翘开，轻轻取下胶条，拨走胶面的琼脂糖，并用塑料尺子在胶面的酸性端切一个小角用去离子水冲洗玻璃板下表面和胶面，并将挤瓶头伸至胶下冲洗，使胶稍微脱离玻璃板，将玻璃板反扣到染色盘上，让胶依靠重力慢慢脱离玻璃板落入染色盘中2).染色：固定 40%MeOH+10%HAc 30min-over night漂洗 H2O 15min X 4次染色 室温摇荡过夜 终止 H2O漂洗至背景清楚3）.染色液：（0.12%G-250,10%100mlH3PO4,10%（NH4）2SO4,20%MeOH)辉骏生物：辉骏生物：http:/ 2、银染：、银染：注：为了与质谱鉴定相兼容，敏化步骤不加戊二醛，银染步骤也不加入甲醛辉骏生物：辉骏生物：http:/ 辉骏生物：辉骏生物：http:/。