生物化学实验技术理论生物化学实验技术理论一、层析技术l19031903年，俄国科学家首创了一种从绿叶中分离多种不同年，俄国科学家首创了一种从绿叶中分离多种不同颜色色素成分的方法，命名为色谱法颜色色素成分的方法，命名为色谱法(Chromatography)(Chromatography)，由于翻译和习惯的原因又常称为层析法由于翻译和习惯的原因又常称为层析法l8080多年来，层析法不断发展，形式多种多样多年来，层析法不断发展，形式多种多样5050年代开年代开始，相继出现了分配层析、离于交换层析、凝胶层析、始，相继出现了分配层析、离于交换层析、凝胶层析、亲和层析、吸附层析等亲和层析、吸附层析等l几乎每一种层析法都已发展成为一门独立的生化高技术，几乎每一种层析法都已发展成为一门独立的生化高技术，在生化领域内得到了广泛的应用在生化领域内得到了广泛的应用一、层析技术l1、层析技术原理、层析技术原理l2、层析技术分类、层析技术分类l3、常用层析技术原理、常用层析技术原理 1、层析技术原理l层析原理：是一种物理的分离方法，利用混合层析原理：是一种物理的分离方法，利用混合物中各组分的物理化学性质的差别，使各组分物中各组分的物理化学性质的差别，使各组分以不同程度分布在两相中，其中一相为以不同程度分布在两相中，其中一相为固定固定相相，另一相流过此相称作另一相流过此相称作流动相流动相，并使各组分以不并使各组分以不同速度移动，从而达到分离的目的。
同速度移动，从而达到分离的目的l可分离物质：可分离物质：糖类、有机酸、氨基酸、核苷酸糖类、有机酸、氨基酸、核苷酸名称名称操作方式操作方式固定相固定相流动相流动相分离依据分离依据分配层析分配层析纸层析纸层析薄层层析薄层层析液体液体液体液体溶解度溶解度离子交换层析离子交换层析离子交换柱层析离子交换柱层析固体固体液体液体带电性带电性静电引力静电引力吸附层析吸附层析吸附薄层层析吸附薄层层析气体吸附层析气体吸附层析固体固体固体固体液体液体气体气体吸附力吸附力亲合层析亲合层析酶与底物酶与底物抗原与抗体抗原与抗体固体固体液体液体配体专一性配体专一性凝胶层析凝胶层析 凝胶过滤凝胶过滤固体固体液体液体分子大小分子大小淀 粉 凝 胶 电 泳 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳琼 脂 糖 凝 胶 电 泳凝 胶 支 持 物 区 带 电 泳纸 电 泳醋 酸 纤 维 薄 膜 电 泳 薄 层 电 泳非 凝 胶 支 持 物 电 泳用 支 持 物 区 带 电 泳显 微 电 泳等 电 聚 焦 电 泳等 速 电 泳不 用 支 持 物 电 泳是 否 用 支 持 物u=v=d/t=dleV/lVt类型类型优点优点缺点缺点纸电泳纸电泳设备操作简单设备操作简单分辨率差，电渗现分辨率差，电渗现象象醋酸纤维薄膜电醋酸纤维薄膜电泳泳设备操作简单，样品设备操作简单，样品用量少用量少分辨率差分辨率差琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳快速，分辨率高快速，分辨率高电渗现象严重电渗现象严重聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶电泳电泳可调节凝胶孔径，样可调节凝胶孔径，样品用量少分辨率高，品用量少分辨率高，无电渗现象无电渗现象高浓度凝胶难剥离高浓度凝胶难剥离 OCH2=CH-C-NH2 O OCH2=CH-C-NH-CH2-NH-C-CH=CH2A.样品的浓缩效应样品的浓缩效应缓冲液成分及缓冲液成分及pH的不连续性的不连续性l浓缩胶浓缩胶l缓冲液缓冲液 浓缩胶浓缩胶Tris-HCl,Tris-HCl,电极缓冲液电极缓冲液Tris-GlyTris-Glyl解离度解离度 ：ClCl 蛋蛋 GlyGlylm mcl clcl clmm蛋蛋蛋蛋m m GlyGly GlyGlyl凝胶中凝胶中ClCl为快离子，为快离子，GlyGly为慢离子，为慢离子，蛋白质样品被夹在中间。
蛋白质样品被夹在中间缓冲缓冲液液样品样品浓缩胶浓缩胶分离胶分离胶缓冲液成分及缓冲液成分及pH的不连续性导致蛋白质样品的不连续性导致蛋白质样品浓缩效应示意图浓缩效应示意图 快离子快离子 慢离子慢离子 蛋白质样品蛋白质样品 E：每厘米的电压降每厘米的电压降 E EI(I(电流强度电流强度)/)/(电导率电导率)E E与电泳速度成正比与电泳速度成正比l电泳开始后，由于快离子泳动电泳开始后，由于快离子泳动率最大，在快离子后面形成一率最大，在快离子后面形成一个离子浓度低的低电导区，产个离子浓度低的低电导区，产生较高的电位梯度，使蛋白质生较高的电位梯度，使蛋白质和慢离子加速移动，蛋白质样和慢离子加速移动，蛋白质样品被进一步浓缩品被进一步浓缩电位梯度的不连续性电位梯度的不连续性lE：每厘米的电压降每厘米的电压降 E EI(I(电流强度电流强度)/)/(电导率电导率)lE E与电泳速度成正比与电泳速度成正比l电泳开始后，由于快离子泳动电泳开始后，由于快离子泳动率最大，在快离子后面形成一率最大，在快离子后面形成一个离子浓度低的低电导区，产个离子浓度低的低电导区，产生较高的电位梯度，使蛋白质生较高的电位梯度，使蛋白质和慢离子加速移动，蛋白质样和慢离子加速移动，蛋白质样品被进一步浓缩。
品被进一步浓缩电位梯度的不连续性电位梯度的不连续性A.样品的浓缩效应样品的浓缩效应 四个不连续性造成样品浓缩效应四个不连续性造成样品浓缩效应原理包括原理包括：l缓冲液成分及缓冲液成分及pHpH的不连续性的不连续性l电位梯度的不连续性电位梯度的不连续性 缓冲液缓冲液浓缩胶浓缩胶样品样品分离胶分离胶A.样品的浓缩效应样品的浓缩效应 四个不连续性造成样品浓缩效四个不连续性造成样品浓缩效应原理包括应原理包括：l凝胶层的不连续性：凝胶层的不连续性：样品进入浓缩胶有一个堆积浓缩样品进入浓缩胶有一个堆积浓缩效应效应(缓冲液缓冲液pH8.3)pH8.3)蛋白质从蛋白质从“”极向极向“”极移极移动，从浓缩胶进入分离胶，速动，从浓缩胶进入分离胶，速度变慢，堆积浓缩度变慢，堆积浓缩缓冲缓冲液液样品样品浓缩胶浓缩胶分离胶分离胶A.样品的浓缩效应样品的浓缩效应 四个不连续性造成样品浓缩效四个不连续性造成样品浓缩效应原理包括应原理包括：l凝胶层的不连续性：凝胶层的不连续性：样品进入浓缩胶有一个堆积浓缩样品进入浓缩胶有一个堆积浓缩效应效应(缓冲液缓冲液pH8.3)pH8.3)蛋白质从蛋白质从“”极向极向“”极移极移动，从浓缩胶进入分离胶，速动，从浓缩胶进入分离胶，速度变慢，堆积浓缩。
度变慢，堆积浓缩缓冲缓冲液液样品样品浓缩胶浓缩胶分离胶分离胶A.样品的浓缩效应样品的浓缩效应 四个不连续性造成样品浓缩效四个不连续性造成样品浓缩效应原理包括应原理包括：l凝胶层的不连续性：凝胶层的不连续性：样品进入浓缩胶有一个堆积浓缩样品进入浓缩胶有一个堆积浓缩效应效应(缓冲液缓冲液pH8.3)pH8.3)蛋白质从蛋白质从“”极向极向“”极移极移动，从浓缩胶进入分离胶，速动，从浓缩胶进入分离胶，速度变慢，堆积浓缩度变慢，堆积浓缩缓冲缓冲液液浓缩胶浓缩胶分离胶分离胶A.样品的浓缩效应样品的浓缩效应 四个不连续性造成样品浓缩效四个不连续性造成样品浓缩效应原理包括应原理包括：l凝胶层的不连续性：凝胶层的不连续性：样品进入浓缩胶有一个堆积浓缩样品进入浓缩胶有一个堆积浓缩效应效应(缓冲液缓冲液pH8.3)pH8.3)蛋白质从蛋白质从“”极向极向“”极移极移动，从浓缩胶进入分离胶，速动，从浓缩胶进入分离胶，速度变慢，堆积浓缩度变慢，堆积浓缩缓冲缓冲液液浓缩胶浓缩胶分离胶分离胶 B.电荷效应电荷效应l蛋白质样品进入分离胶后蛋白质样品进入分离胶后 pHpH增大增大(pH 8.9)(pH 8.9)，GlyGly解离度增解离度增大，不存在快、慢离子之分，大，不存在快、慢离子之分，蛋白质样品在均一电场强度和蛋白质样品在均一电场强度和pHpH条件下泳动。
条件下泳动l由于各种蛋白质由于各种蛋白质pI不同，所载不同，所载有效电荷不同，因此质点的有效电荷不同，因此质点的 有有效迁移率不同，形成不同区带效迁移率不同，形成不同区带缓冲缓冲液液浓缩胶浓缩胶分离胶分离胶 C.分子筛效应分子筛效应l分离胶的孔径小，各分子分离胶的孔径小，各分子由于大小和形状不同，所由于大小和形状不同，所受阻力不同，表现出不同受阻力不同，表现出不同的的 泳动速度，即分子筛作泳动速度，即分子筛作用分子量小，形状为球用分子量小，形状为球形的泳动速度最快形的泳动速度最快缓冲缓冲液液浓缩胶浓缩胶分离胶分离胶。