实验二 碱变性法提取质粒 DNA实验目的提取基因工程中运载基因的载体，掌握最常用的提取质粒 DNA 的方法实验原理碱变性提取质粒DNA是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异 而达到分离目的在pH高达12.6的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双 螺旋结构解开而变性质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状 的两条互补链不会完全分离，当以pH4. 8的NaAc高盐缓冲液去调节其pH至中 性时，变性的质粒 DNA 又恢复原来的构型，保存在溶液中，而染色体 DNA 不 能复性而形成缠连的网状结构，通过离心,染色体DNA与不稳定的大分子RNA、 蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去实验材料和试剂(一)实验材料大肠杆菌DH-5 (pUC118)(使用实验一转化平板上的菌)二)培养基和试剂1. LB 液体培养基同实验一2. 抗生素：氨苄青霉素(ampicillin, Amp)，配制成100mg/ml备用3. 溶液 I ：50mmol/L 葡萄糖25mmol/L Tris-HCl( pH8. 0) 10mmol/L EDTA( pH8. 0)2mg/ml 溶菌酶4. 溶液 II ：200mmol/L NaOH1%SDS5. 溶液 III ：3mol/LNaAc( pH4. 8)溶液6. TE缓冲液：10mmol/LTris-HCl( pH8. 0)1mmol/LEDTA7. 预冷的无水乙醇（三）器材接种针1ml 移液管1.5ml Eppendorf 管200pl吸头冰块牛皮纸纱布盖线绳（四）仪器微量移液器涡流混合器低温高速离心机实验步骤1.取100mg/ml的氨苄青霉素20卩1加入到20ml LB液体培养基（20ml/250ml 三角瓶）中，使氨苄青霉素的含量为1OOpg/m 1,分装到5X 150mm试管中，每 管3ml。
分别挑取实验一转化平板上的单菌落，接种到含有1OOpg/m1氨苄青霉 素的LB液体培养基（3ml/试管）中（每组挑2个菌落）37°C振荡培养过夜（约 16 小时）自下一步骤起不需无菌操作2. 取1ml菌液于1. 5ml Eppendorf管中，3000r/min离心5分钟，弃去上清 液，湿菌体在涡流混合器上振荡均匀3. 加入100山溶液I,摇匀冰浴10分钟4. 加入200山溶液II,温和振荡，溶液变粘稠，而且清亮透明，冰浴10分 钟5. 加入150山溶液III，温和振荡，出现白色沉淀，冰浴10分钟6. 4°C 10,000r/min离心10分钟，将上清液小心倒入另一个新Eppendorf管 中，加入800卩1预冷的无水乙醇20C冰箱中放置1小时，沉淀DNA7. 4C 10,000r/min离心10分钟，弃去上清液，将Eppendorf管中所有液体 挥发干净8. 加入20卩1 TE缓冲液溶解DNA提示】(一)一些试剂的生化作用原理1 •溶液I —溶菌液：① 溶菌酶：它是糖苷水解酶，能水解菌体细胞壁的主要化学成分肽聚糖中 的p-1,4糖苷键，因而具有溶菌作用其最适pH为8.0② 葡萄糖：增加溶液的粘度，维持渗透压，防止 DNA 受机械力作用而降 解。
③ EDTA：螯合Mg2+、Ca2+等金属离子，抑制DNase对DNA的降解作用 另外， EDTA 的存在，有利于溶菌酶的作用，因为溶菌酶的反应要求有较低的离 子强度的环境2.溶液 II— NaOH-SDS 液：① NaOH： DNA在pH大于5、小于9的溶液中是稳定的但当pH > 12或 pH <3时，就会引起双链之间的氢键解离而变性溶液II中的NaOH浓度为 200mmol/L,加到提取液中时，该系统的pH就高达12.6,因而促使染色体DNA 与质粒DNA的变性② SDS： SDS 是离子型表面活性剂它主要功能是溶解细胞膜上的脂质和 蛋白，因而溶解膜蛋白破坏细胞膜; 解聚细胞中的核蛋白; SDS 能与蛋白质结合 成为r-o-so3「.R+—蛋白质复合物，使蛋白质变性而沉淀下来3 •溶液 III— 3mol/L NaAc (pH4. 8)溶液：NaAc的水溶液呈碱性，为了调节pH至4.8,必须加入大量的冰醋酸，所以 该溶液实际上是NaAc-Hac的缓冲液用pH4. 8的NaAc是为了把pH12. 6的提 取液调回至pH中性,使变性的质粒DNA能够复性，并稳定存在而高盐的3mol/L NaAc可以中和核酸上的电荷，减少相斥力，有利于变性的大分子染色体DNA、RNA互相聚合而沉淀下来，同时钠盐与SDS-蛋白复合物作用后，能形成较小的 钠盐形式复合物，使沉淀更完全。
4．沉淀 DNA乙醇可以任意比例和水相混溶，乙醇与核酸不会起任何化学反应，对 DNA 很安全，因此是理想的DNA沉淀剂DNA溶液中DNA是以水合状态稳定存在 的，当加入乙醇时，乙醇会夺去DNA周围的水分子，使DNA失去水而易于聚 合二）实验操作中注意的问题1. 该实验最重要的是去掉染色体DNA，在全部提取过程中，只有一次机会 去除染色体DNA，其关键步骤是加入溶液II和溶液III时，控制变性与复性操作 时机，既要使试剂与染色体 DNA 充分作用使之变性，又要使染色体 DNA 不断 裂成小片段，从而能与质粒DNA相分离这就要求试剂与溶菌液充分摇匀，摇 动时用力要适当一般加入溶液I时可用力振荡几次，因为此时细菌还没有与溶 菌酶完全作用，染色体DNA尚未释放出来，不必担心其分子断裂加入SDS以 后，必须注意不能过分用力振荡，但又必须保证溶液混合充分，可上下颠倒 Eppendorf 管数次，直至混匀2. 加入溶液 II 5 分钟后，如果溶液不变粘稠时，实验不能继续做下去，要 检查所用的试剂是否正确，数量是否符合，待找出原因改正后才可继续进行下去， 否则，提取到最后，将得不到质粒DNA或收率极低。
3. 加入乙醇沉淀 DNA 时，要把离心管盖上盖子倒翻摇动几次，注意观察 水相和乙醇之间没有分层现象之后，才可以放到冰箱中去沉淀DNA附录1 •溶液I配制方法：葡萄糖 0.991g双蒸馏水 80ml250mmol/L EDTA 4ml1.0mol/L Tris-HCl（pH8.0） 2.5ml用双蒸馏水定容至100ml，0.07Mpa高压灭菌20分钟，4°C保存，临用时加入 200mg 溶菌酶2mol/L NaOH10ml10ml80ml2.溶液II配制方法:10% SDS双蒸馏水 最好现用现配，不需灭菌思考题】 如果提取的质粒有降解，应如何解决？。