重亚硫酸盐修饰基因组DNA的制备采用EZ DNA Mehtylation-Gold KitTMD5005试剂盒，按照操作说明书分别对提取的Blank、Cya基 因组DNA进行重亚硫酸盐修饰1. 分别吸取10 uL Blank和Cya DNA样品到PCR管中，加入10 uL水补足20 uL，每个 样品加130uL CT conversion reagent轻弹管子或者用枪吹打混匀，离心使液体沉到管 底2. 将管子放到热循环仪中，运行以下步骤：1. 98°C lOmin2. 64C 2.5h3. 4C保存可至20h3. 力口 600 u L M-Binding Buffer 到 Zymo-SpinTMIC Column,柱子放在提供的收集管中4. 把样品（来自步骤2）加到装M-Binding Buffer的Zymo-SpinTMIC Column中盖上盖子， 颠倒混匀5. 全速离心（210000g） 30s倒掉流穿液6. 力口 100 uL M-Wash Buffer到柱子上全速离心30s7. 力口 200 u L M-Desulphonation Buffer 到柱子上，室温（20C-3OC ）静置 15-20min。
孵育 完成后，全速离心30s8. 力口 200 uL M-Wash Buffer 到柱子上全速离心 30s另加 200 uL M-Wash Buffer，再离 心 30s9. 把柱子放到1.5mL离心管垂直加10 uL M-Elution buffer到柱子基质全速离心30s 洗脱DNA二． PCR 扩增反应模板：重亚硫酸盐修饰的Blank、Cya基因组DNA引物上游：CTCAAGCTTCGAATTTTTTTATAAGAAGAAGATAAG 下游：TAGATCCGGTGGATCAAAACTCCACCACAAACCACTT 目的片段长度：476bp1. 操作步骤：反应体系模板 0.5uL10XKOD plus buffer 5 u LdNTPS Mixture(2.5mM each) 5uLMg2+4uL上游引物3uL下游引物3uLDMSO4uLKOD plus 酶2uLddH2O23.5uLTotal50uL反应条件：1) 95 °C 3min2) 95C 25s； 48C 15s； 72C 45s35Cycles3) 72C 10min； 4C 8电泳将上述50uL PCR产物与10uL 6XLoading Buffer混匀，经1%琼脂糖凝胶电泳：125V, 25min ；凝胶图像分析系统观察结果，拍照。
M Blank Cya结果：20001000750500250100目的片段切胶回收按照AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒说明书回收目的片段1. 在紫外灯下切下含有目的DNA的琼脂糖凝胶，计算凝胶重量，该重量作为一个凝胶 体积2. 加入3个凝胶体积的Buffer DE-A，混合均匀后于75C加热，间断混合，直至凝胶 块完全熔化3. 加0.5个Buffer DE-A体积的Buffer DE-B，混合均匀4. 吸取步骤3中的混合液，转移到DNA制备管中，12000Xg离心1min5. 将制备管置回2mL离心管，加500 uL Buffer W1, 12000Xg离心30s，弃滤液6. 将制备管置回2mL离心管，加700 uL Buffer W2, 12000Xg离心30s，弃滤液以 同样的方法再用700 uL Buffer W2洗涤一次，12000Xg离心1min7. 将制备管置回2mL离心管中，12000Xg离心2min8. 将制备管置于洁净的1.5mL离心管中，在制备膜中央加25 uL加热至65C的去离 子水，室温静置1min12000Xg离心1min洗脱DNA三． 重组1. YFPC1 质粒 EcoR I、BamH I 双酶切将抽提好的YFPC1质粒按以下步骤进行双酶切。
反应体系：EcoRI1uLBamHI1uLYFPC1质粒5uL10XK2uLH2O11uL共4管反应条件：37 °C 2h 酶切完成后，4管合成2管，1%琼脂糖凝胶检测，结果正确切胶回收2. 连接采用 GenaCopoeia Fast-Fusion™克隆试剂盒反应体系：YFPC1双酶切产物 5uL目的片段 3UL10X Clonase Buffer 1 u LFast-FusionTMClonase 1 u L轻弹管壁使配置好的反应液分散均匀25C温育15min冰上保存直至转化四． 转化1. 从-80C冰箱取出大肠杆菌DH5a感受态细胞悬液，室温解冻，解冻后立即置于冰上2. 将重组产物全部加入感受态中，轻弹混匀，冰上放置30min3. 42C水浴中热击90s，热击后迅速置于冰上冷却3-5min4. 向管中加入800uL无抗LB液体培养基，混匀后摇床37C，200rpm培养1h5. 菌液5000rpm离心5min，倒掉上清，混匀，均匀涂于LB （K+抗性）平板，37C培养箱培 养过夜五． 摇菌测序分别挑取Blank、Cya组20个转化子，3mL LB （K+抗性）培养基37C摇床200rpm过夜培养。