抗菌药物最小抑菌浓度的测定一、 概念：最小抑菌浓度〔minimum inhibitory concentration, MIC〕：在特定环境下孵育24小 时，可抑制某种微生物出现明显增长的最低药物浓度即最小抑菌浓度，用于定量测定体外抗 菌活性二、 实验目的：通过采用常量稀释法, 检测几种抗菌药物对 菌株的最小抑菌浓度( MIC) ,对临床诊断用药有指导作用三、仪器和试剂：MH液体培养基无菌试管分光光度计0.5麦氏标准比浊管MH琼脂微量加样器蒸馏水吸头0.1mol磷酸缓冲液〔PH6.0〕接种环无菌生理盐水无菌平板无菌滤膜0.22无菌针筒金黄色葡萄球菌、大肠 埃希菌、铜绿假单胞菌抗菌药物四、检验方法：液体稀释法、琼脂稀释法、E试验〔E test〕 液体稀释法操作步骤：抗菌药物原液配置OOOOOOOOOOOOOMH液体试管中抗菌药物梯度稀释观察结果1..抗菌药物原液制备抗菌药物贮存液浓度不应低于1000ug/ml(如1280ug/ml)或10倍于最高测定浓度溶 解度低的抗菌药物可稍低于上述浓度所需抗菌药物溶液量或粉剂量可公式进展计算例如：需配制100 ml浓度为1280iag/ml的 抗生素贮存液，所用抗生素为粉剂，其药物的有效力为750pg/mgo用分析天平准确称取抗 生素粉剂的量为182.6 mgo根据公式计算所需稀释剂用量为：〔182.6 mgx750pg/ml]/1280 Mg/ml=107.0ml，然后将 182.6 mg抗生素粉剂溶解于107.0ml稀释剂中。
制备抗菌药物贮存 液所用的溶剂和稀释剂见表1配制好的抗菌药物贮存液应贮存于-20°C环境，并注意抗菌 药物的保存期限表1 稀释法中常用的抗菌药物容积稀释法药物浓度取药液量加稀释剂量药物稀释浓琼脂或肉汤中最后含药浓度〔ug/ml〕〔ml〕〔ml〕度〔ug/ml〕〔ug/ml〕药物：琼脂〔或肉汤〕=1： 95120105120512512011256025651201312801281280116406412801332032128017160161601180816013404160172022011101201350.520172.50.252.5111.250.1252.5130.60.062.5170.30.032•药敏试验用抗菌药物浓度X围根据NCCLS抗菌药物敏感性试验操作标准，药物浓度X围 应包含耐药、中介和敏感分界点值，特殊情况例外3•培养基NCCLS推荐使用Mueller-Hinton〔MH〕肉汤,pH7.2~7.4需氧菌及兼性厌氧菌在 此培养基中生长良好在测试葡萄球菌对苯唑西林的敏感性时，应在肉汤中参加2%〔W/V〕 氯化钠，按制造厂家的要求配制需要量的MH肉汤嗜血杆菌属菌使用HTM肉汤，肺炎链 球菌和其它链球菌使用含2%~5%溶解马血的MH肉汤。
4.接种物的制备有2种方法配制接种物，一是细菌生长方法，用接种环挑取形态相似待检 菌落3-5个，接种于4-5m I的水解酪蛋白〔M H〕肉汤中，35°C孵育2-6h增菌后的对数生 长期菌液用生理盐水或M H肉汤校正浓度至0.5麦氏比浊标准，约含1 ~2x108CFU/mI二是 直接菌落悬液配制法，对某些苛养菌，如流感嗜血杆菌、淋病奈瑟菌和链球菌及甲氧西林耐 药的葡萄球菌等菌株，推荐直接取培养18~24h的菌落调配成 0.5麦氏比浊标准的菌悬液 用MH肉汤将上述菌悬液进展1 ：100稀释后备用注意应在15分钟内接种完配制好的接种 物，并取一份接种物在非选择性琼脂平板上传代培养，以检查接种物纯度5•稀释抗菌药物的制备及菌液接种取无菌试管〔13x100mm〕13支，排成一排，除第1管 参加1.6mIMH肉汤外，其余每管参加MH肉汤1ml，在第1管参加抗菌药物原液〔如1280 M g/ml ] 0.4m I混匀，然后吸取1m I至第2管，混匀后再吸取1m I至第3管，如此连续倍比 稀释至第11管，并从第11管中吸取 1ml弃去，第12管为不含药物的生长对照此时各管 药物浓度依次为256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25pg/mlo然后在每管内参加 上述制备好的接种物各1 ml，使每管最终菌液浓度约为5x105CFU/mlo第1管至第11管药物 浓度分别为 128、64、32、16、8、4、2、1、05、0.25、0.125ug/ml。
另外设对照 3 支，别 为肉汤对照、质控菌对照和待测菌生长对照6•孵育将接种好的稀释管塞好塞子，置35C普通空气孵箱中孵育16~20h；嗜血杆菌和链球 菌在普通空气孵箱中孵育20~24h；对可能的耐甲氧西林葡萄球菌和耐万古霉素肠球菌应持 续孵育满 24ho7•结果判断与解释在读取和报告所测试菌株的MIC前，应检查生长对照管的细菌生长情况 是否良好，同时还应检查接种物的传代培养情况以确定其是否污染，质控菌株的 MIC 值是 否处于质控X围以肉眼观察，药物最低浓度管无细菌生长者，即为受试菌的MIC °甲氧苄 胺嘧啶或磺胺药物的肉汤稀释法终点判断，与阳性生长对照管比拟抑制 80%细菌生长管药 物浓度为受试菌MICMIC参考X围】表2稀释法质控标准菌株MIC预期值X围〔ug/ml〕抗菌药物金黄色葡萄球菌〔ATCC29213〕粪肠球菌〔ATCC29212〕大肠埃希菌〔ATCC25922〕铜绿假单胞菌〔ATCC27853〕青霉素G0.25~1.01.0-4.0——苯唑西林0.12-0.5———甲氧西林0.5~2.0———氨苄西林—0.5-2.02.0-8.0—哌拉西林——1.0-4.01.0-4.0头孢噻吩0.12-0.5—4.0-16—头孢唑啉0.25-1.0—1.0-4.0—头孢呋辛——2.0-8.0—头孢他啶——0.06-0.51.0-4.0头孢唑肟——0.03-0.1216-64氨曲南——0.06 - 0.252.0-8.0庆大霉素0.12-1.0—0.25-1.01.0-4.0阿米卡星——0.5-4.02.0-8.0克林霉素0.06 - 0.25———红霉素0.12-0.51.0-4.0——万古霉素0.5-2.01.0-4.0——环丙沙星0.12-0.50.25-2.00.004 - 0.0150.25-1.0常用抗菌药物稀释和配制方法药物溶媒配制方法青霉素N.S-次氨苄西林N.S-次氨苄西林氟氯西林N.S-次氨苄西林舒巴坦N.S-次阿莫西林氟氯西林N.S-次阿莫西林舒巴坦N.S-次阿莫西林克拉维酸N.S-次奈夫西林N.S-次阿洛西林5%GNS, 5-10%G.S二次，每g先用10m 1注射用水溶解美洛西林5%GNS, 5-10%G.S-次美洛西林舒巴坦N.S,5%GNS,5-10%G.S二次，先用适量注射用水或生理盐水溶解羧苄西林5%G.S-次替卡西林克拉维酸5%G.S二次，先用10ml注射用水溶解哌拉西林无-次哌拉西林他唑巴坦5%G.S, NS-次哌拉西林舒巴坦5%G.S, NS-次苯唑西林N.S, G.S-次头孢唑啉N.S, G.S二次，先用注射用水溶解五水头孢唑啉N.S, 5%G.S二次，先用注射用水溶解头孢硫脒N.S-次头孢噻吩N.S, 5%G.S二次•先4g用20ml注射用水溶解头孢呋辛无-次头孢美唑N.S, G.S-次头孢替安N.S, G.S-次头孢替唑N.S, G.S-次头孢尼西N.S, 5-10%G.S-次头孢西丁N.S, 5-10%G.S-次头孢孟多N.S, 5%G.S-次头孢他定N.S, 5%G.S-次头孢曲松N.S, 5%G.S二次，先用注射用水、N.S、G.S配成0.1g/ml头孢哌酮G..N.S—次，终浓度为5-25mg/ml头孢哌酮舒巴坦N.S, 5%G.S二次, 1g —水溶后总量4 ml，再用同一溶媒溶解。
头孢哌酮他唑巴坦N.S, 5%G.S二次•先用注射用水、N.S 5-10ml溶解拉氧头孢N.S, 5%G.S-次头孢米诺N.S, 5-10%G.S-次头孢唑肟N.S, 10%G.S-次头孢地嗪N.S，林格，5%G.S-次头孢甲肟N.S, G.S-次头孢匹胺N.S, G.S-次头孢吡肟N.S, G.S-次头孢匹罗N.S，G.S-次亚胺培南西司他汀N.S，G.S-次美罗培南N.S，5-10%G.S二次，可先用适宜液体配制氨曲南N.S，5-10%G.S二次, 1g先用至少3ml注射用水溶解，终浓度不超过2%阿奇霉素N.S，5%G.S二决先用注射用水稀释成0.1mg/ml，再稀释成终浓度为1 -2mg/ml依替米星N.S，5%G.S-次多西环素N.S，5%G.S二次•先用注射用水或其他溶液稀释成 10mg/ml，再溶解成克林霉素无0.1-1mg/ml次万古霉素N.S，5%G.S二次.先用10ml注射用水溶解，再参加至少200ml溶液中滴注＞1去甲万古霉素N.S，5%G.S小时先用注射用水溶解，再用至少200ml液体慢滴替考拉宁N.S，5%G.S二次•先用注射用水溶解，双手滚动小瓶至药粉全部溶解。
如果 岀现泡沫，静置15分钟培氟沙星5%G.S-次氟罗沙星5%G.S-次洛美沙星N.S，5%G.S二次，先用5ml注射用水溶解左氧氟沙星N.S， G.S-次加替沙星N.S，5%G.S一次，终浓度为2mg/ml依诺沙星5%G.S-次帕珠沙星N.S-次利福霉素5%G.S-次氟康唑无-次两性霉素B5%G.S〔用NS有沉淀〕二次.5ml注射用水溶解25mg药物，终浓度＜0.1mg/ml，避光慢滴6h 1以卜阿昔洛韦N.S，5%G.S（冋5 1以丄二次•每0.1g用10m l注射用水溶解成50g/l再用大瓶稀释成至 少100ml终浓度不超过7g/l注意水化更昔洛韦N.S，5%G.S先用N.S或注射用水溶解，再用大瓶稀释成100ml浓度不超过 10mg/ml,-次 最大量 6mg/kg聚安洛韦N.S，5%G.S-次膦甲酸钠无—决注意水化〔2.5L/d〕，可适当用利尿剂，慢滴阿糖腺苷无一决日剂量＜10mg/kg病毒唑N.S，5%G.S—决1mg/ml，慢滴磷霉素N.S, 5%G.S先用注射用水溶解慢滴1-2小时总结：1 N.S溶解：青霉素、氨苄西林类、阿莫西林类、奈夫西林、头孢硫脒、帕珠沙星〔阿青安怕牛来〕2. G.S 溶解:培氟沙星、氟罗沙星、曲伐沙星、依诺沙星、两性霉素B/利福霉素〔两粒〕3. 需二次配制的：青霉素类：阿洛西林、美洛西林舒巴坦、替卡西林克拉维酸〔阿美卡拉〕；头孢类：唑 啉、噻吩、曲松、哌酮舒巴坦〔他唑巴坦〕；两粒霉素B、磷霉素、多西环素、阿奇霉素、洛美沙星〔20 多哈罗〕、万古霉素、去甲万古霉素、替考拉宁；阿昔洛韦、更昔洛韦、氨曲南、美罗培南。