1、细胞细胞对 GNPs 的摄取(1) 取处于对数生长期的 A549 细胞，接种于 25cm2 的培养瓶中;(2) 待细胞生长至70%-80%时,弃去培养液，更换为浓度均为5nM的GNPs培养液， 继续培养细胞;(3) 药物处理后分别于6, 12, 24, 48h后收集细胞于15ml离心管中在胰蛋白 酶消化细胞前，弃去旧的培养液，PBS冲洗细胞2次，去除培养液中未被细胞吸 收的游离的纳米颗粒收集细胞悬液，计数细胞总量N},加入PBS至5ml;(4) 加入5 ml 20%HNO3溶液，混合均匀，室温下静置48h充分裂解细胞；(5 ) ICP-AES测定裂解液中金原子的质量浓度，按方法计算纳米颗粒的摩尔浓 度及纳米颗粒的总数量NGNPs因此每个A549细胞内的纳米颗粒的量n= NGNPs } Nc;(6)实验重复至少3次2. GNPs 在细胞内的分布(1) 取处于对数生长期的细胞，接种于25cm2的培养瓶中；(2) 待细胞生长至70%-80%时，弃去培养液，更换为含有浓度为5nM的GNPs的培 养液，继续培养细胞；(3) 24h后弃去培养液，PBS冲洗2次，胰蛋白酶消化后离心收集细胞；(4) 电镜标本制作步骤:① 固定:在离心所得的细胞团块中加入2.5%戊二醛2m1固定至少4h;② 漂洗:固定后PBS漂洗2次；③ 脱水:细胞团块脱水按梯度进行，依次为70%丙酮15分钟，80%丙酮15分钟， 90%丙酮15分钟，100%丙酮1o分钟(2次)；④ 浸透和包埋:将样本用环氧树脂包埋，然后置烤箱烘干，在450C (12小时)、 600C(36小时)烤箱内加温，即可聚合硬化，形成包埋块；⑤ 超薄切片:将包埋好的蜡块熔粘在特制的木块上，然后固定在旋转切片机上进 行一切片；⑥ 载网:将切片置于直径为3 mm的圆形铜网上；⑦ 染色:预先取一个清洁的培养皿，将石蜡溶解制作成蜡板，然后滴数滴染液于 蜡板上用摄子夹住载网的边缘，把贴有切片的一面朝下，使载网浮在液滴上，盖 上培养皿，染色10-20分钟。
载网从染液中取出后，尽快用蒸馏水清洗干净；(5) 电镜观察、拍片及记录:做好观察记录，选好范围拍片，准确记录底片号码及 相应内容，然后在电脑中备案3. MTT实验检测GNPs对A549细胞的毒性作用(1) 取处于对数生长期的A549细胞，以5000/孔的密度接种于9G孔板中；(2) 培养过夜，待细胞贴壁生长后，弃旧培养液，加入小同浓度梯度(0nM, 5nM,l 0nM, 20nM) 的 GNPs 培养液；(3) 培养24h后，弃培养液，PBS冲洗2 次,以去除培养液中游离GNPs,加入新鲜 培养液继续培养；(4 ) MTT实验检测不同时间梯度(24h, 48h, 72h)细胞的存活分数；MTT 的实验步骤:① 每孔培养液加入20ul MTT溶液((5 mg/m I )，继续培养4h;② 止培养，小心吸去孔内培养液每孔加入150ulDMSO,放置摇床低速振荡lOmin, 使结晶物充分溶解；③ 酶联兔疫检测仪检测 490/560nm 处各孔的吸光度值 ;④ 下列公式计算各孔细胞的存活率 : 细胞存活率二 ( 实验组 OD 值一空白对照组OD值)/(对照组0D值一空白对照组0D值)X I 00%⑤ 组细胞至少重复 3 次。
4. MTT实验检测GNPs对细胞的放疗增敏效应及对正常细胞保护(1) 实验分4组:①对照组，②药物(GNPs)组,③照射(IR)组，④联合组(GNPs+ IR);(2) 取处于对数生长期的细胞，以 5000/孔的密度接种于96 孔板中;(3) 培养过夜，待细胞贴壁生长后，弃旧培养液，加入不同浓度梯度 0nM, 5nM, IOnM, 20nM)的 GNPs 培养液；(3) 培养24h后，弃培养液，PBS冲洗2次，以去除培养液中游离的GNPs，加入 新鲜培养液继续培养;(4) ③组和④组行X线照射，剂量为lOGy(6MV X-ray，SSD 100cm，加2cm等效 物);(5) 培养 24 小时后用 MTT 法检测各孔细胞的存活率实验原理及步骤同上5. 细胞克隆形成实验(1) 实验分4组:①对照组，②药物(GNPs)组，③照射(IR)组，④联合组(GNPs+ IR)，其中③、④组按不同照射剂量分为不同的亚组；(2) 将对数生长期的细胞，台盼蓝染色活细胞计数(活细胞比例须＞90% ) ;(3) 设定照射剂量分别为0Gy, 2Gy, 4Gy, 6Gy, 8Gy及10Gy，依照剂量梯度 将不同数量的细胞接种于6孔板中(分别为50, 200, 400,1000,2000,5000);(4) 培养过夜，待细胞贴壁生长后，弃旧培养液，②、④组加入浓度为20nMGNPs 培养液，继续培养;(5) 24h后弃培养液，用PBS冲洗2次，各组均加入新鲜的培养液；(6) ③、④组中各亚组按不同剂量梯度进行照射；(7) 处理结束后将细胞置于培养箱中继续培养10-14天，注意定期更换培养液；(8) 当6孔板中出现肉眼可见的克隆时，终止培养，弃培养液，PBS洗涤2次， 加入纯甲醇固定15分钟。
弃固定液，加Gimsa染液染色20分钟，洗去染色液， 干燥；(9) 镜下观察并计数＞50 个细胞的克隆数；(10) 按下列公式计算存活分数，绘制细胞存活曲线:克隆接种率(pla ting et }iciency, PE) = (对照组克隆数/接种细胞数)X 100%；存活分数(surviving fraction，SF)=实验组克隆数/(接种细胞胞数XPE ):6. 流氏技术检测细胞周期的分布(1) 实验分4组:①对照组，②药物(GNPs)组，③照射(IR)组，④联合组(GNPs+ IR)(2) 取对数生长期的A549细胞，以2X10^5/孔的密度接种于6孔板中；(3) 培养过夜，待细胞贴壁生长后，弃旧培养液，②、④组加入浓度为20nM的-GNPs 的培养液；(4) 培养24h后弃培养液，PBS冲洗2次，加入新鲜培养液，③、④组给予照射 剂量 l0Gy；(5) 处理结束后继续培养24小时，然后收集细胞；(6) 用冰浴预冷PBS洗涤细胞两遍，1,000rpm离心5min，弃上清，缓慢加入lml 冰浴预冷的70%乙醇，轻轻吹打混匀，4°C固定过夜，1,000rpm离心5min，弃上 清，收集固定细胞，用PBS洗涤细胞，l,000rpm离心5min，弃上清，每管细胞 加入0. 5m1碘化丙叮染色液，缓慢充分重悬细胞，37°C避光温浴30min,立即 放入冰浴中，再加入100mg/l PI溶液800ul, 40C避光放置30min,采用型流式 细胞仪分析细胞周期。
实验重复3次7. 流氏技术检测细胞凋亡(1) 实验分4组:①对照组，②药物(GNPs)组,③照射(IR)组，④联合组(GNPs+ IR);(2) 取对数生长期的细胞，以2X10^5/孔的密度接种于6孔板中；(3) 培养过夜，待细胞贴壁生长后，弃旧培养液，②、④组加入浓度为20nM的 GNPs 的培养液;(4) 培养24h后弃培养液，PBS冲洗2次，加入新鲜培养液，③、④组给予照射 剂量 I0Gy;(5) 处理结束后继续培养24小时，然后收集细胞;(6) 用冷PBS洗涤细胞两次，2000rpm离心Smin，收集细胞；⑺用400p1 Annexin V结合恳浮细胞，细胞浓度大约为1 X 10飞/ml;(8) }在细胞恳液中加入5ul Annexin V-FITC染色液，轻轻混匀后4C避光条件 下孵育 15 分钟;(9) 加入10ulPI染色液后轻轻混匀后轻轻混匀后4C避光条件下孵育5分钟(10) 在1小时内用流氏细胞仪检测，每份标木累计分析10000个细胞;8．细胞内活性氧自由基测定细胞内活性氧自由基(ROS测定需要一种荧光探针一 CM-H2-DCFH-DA,其原理为 入细胞内:CM-H2-DCFH-DA本身没有荧光，可以通过扩散作用透过细胞膜进并在 细胞内酶的水解作用下脱去乙酞基团，形成的DCFH过细胞膜从而保留在细胞内。
细胞内的活性氧能够氧化无荧光的DCFH，不能透生成有荧光的DCF因此，如 果细胞内存在ROS，可通过检测DCF的荧光强弱直接反映出细胞内ROS的水平 实验过程如下:准备边长为 12~的盖玻片，冲洗干净且高压消毒，备用6 孔板的每个孔中加入一个盖玻片，将细胞接种于此孔，过夜，制备细胞爬片 将细胞随机分四组①对照组，②GNPs组，③X—线照射组，GNPs + X-线照射 组去掉旧培养液，①组和③组更换含10%FBS的新鲜培养液;②组和④组更换含 有终浓度为5nM的GNPs的无血清培养液继续培养24小时③组和④组分别采 用90kvp和6MV X 一射线发射机照射，剂量为8Gy照射完毕后，更换含10%胎 牛血清的培养液继续培养24小时按照活性氧检测试剂盒说明书步骤操作，吸掉各孔培养液并用PBS溶液冲 洗2次，加入含DCFH-DA C 10}M)的缓冲液，覆盖住盖玻片即可，37 0C孵育 20 分钟吸掉缓冲液， PBS 溶液冲洗 3 次，将盖玻片转移至载玻片上，并滴入 抗荧光淬灭剂，制片完成。