胃癌靶向治疗的分子基础

胃癌靶向治疗的分子基础【摘要】 　　胃癌的死亡率在全球癌症死亡率中居第二位，而在中国、日本、韩国等亚洲国家其死亡率更是居于榜首不幸的是，大多数胃癌患者确诊时疾病已经进入晚期，此时传统的手术治疗、化疗及放疗都不能有效降低患者的死亡率近几十年来一种新的治疗模式——肿瘤分子靶向性治疗正逐渐在抗肿瘤治疗中占据自己的舞台，并显示出良好的应用前景本文将就目前该领域的研究热点，结合本实验室的研究成果，从胃癌靶向性分子的筛选与应用、调整肿瘤微环境和抗肿瘤免疫治疗等三方面对胃癌靶向性治疗的分子基础加以概述 【关键词】 胃癌；靶向治疗；免疫治疗　　ABSTRACT: Gastric cancer is the second leading cause of cancer mortality worldwide, and in Asian countries like Japan, Korea and China, it remains the top killing cancer. As most cases of gastric cancer are in the advanced stage of the disease when they are first diagnosed, patients receiving conventional therapies including surgery, chemotherapy and radiotherapy have poor prognosis. An emerging modality called tumor molecular targeted therapy provides promise and insight to combat this malignancy. This article discusses the molecular basis of gastric cancer targeted therapy from the perspectives of screening and application of target molecules, modulation of tumor microenvironment and antitumor immunotherapy.　　KEY WORDS: gastric cancer; targeted therapy; immunotherapy　　胃癌是全球发病率最高的癌症之一，每年新发病例近百万，其中约2/3的患者来自发展中国家，仅中国就占到42%[1]；同时胃癌又是世界第二大癌症致死原因，在日本、韩国、中国等亚洲国家胃癌的死亡率更是位居恶性肿瘤之首[2]。

大部分胃癌患者确诊时已是癌症晚期，传统的手术治疗及放疗、化疗等方法疗效欠佳，患者5年生存率低于30% 　　传统抗癌治疗中细胞毒性化疗药物占很大比重这类药物的细胞毒作用主要是通过干扰DNA合成与修复或阻碍细胞的有丝分裂来实现的，但由于其作用靶点同时也普遍存在于正常增殖细胞中，其结果必然导致严重的毒副作用针对这一问题，一种新的治疗模式——肿瘤分子靶向性治疗正日益兴起并取得了喜人的成果肿瘤靶向性治疗是指将肿瘤组织或细胞的特异性(或相对特异性)分子作为靶标，利用能与这些靶分子特异性结合的抗体或配体实现直接或导向治疗的目的[3]这种治疗模式为抗肿瘤治疗另辟蹊径研究者们基于对肿瘤生物学行为的改变，尤其是分子水平变化的研究结果，逐步创建出特异性针对肿瘤细胞或其赖以生存的微环境的靶向疗法，既提高了疗效，又减少了毒副作用的产生此外，对肿瘤特异性抗原及靶向肽的筛选有望通过介导宿主对肿瘤的免疫应答来改善抗肿瘤免疫治疗的效果　　1 肿瘤靶向性分子的筛选与应用 基于靶向性分子(单克隆抗体、小分子及反义寡核苷酸等)的抗肿瘤治疗目前已部分进入临床，用于诱导凋亡和特异性地阻断生长因子(EGF/EGFR、VEGF/VEGFR、PDGF/PDGFR等)及相关激酶的作用。

其中最成功的范例当推BcrAbl激酶抑制剂甲磺酸伊马替尼(格列卫)该药通过使异常的BcrAbl激酶失活起到治疗慢性髓性白血病(CML)及胃肠间质瘤(GIST)的作用[4]此外，许多实体肿瘤中存在异常信号传导通路，如Ras/MAPK通路、PI3K/Akt通路、酪氨酸激酶(RTKs)通路等其中RTKs通路作为促进细胞增殖的主要信号通路与肿瘤的发生发展密切相关，该通路中的ErbB家族更是近年来研究的热点该组原癌基因编码产物属于表皮生长因子受体，针对这类受体的靶向性药物可以对恶性细胞产生特异性的攻击，目前已获得的代表性的药物有用于乳腺癌治疗的曲妥珠单抗(赫赛汀)和用于非小细胞肺癌治疗的厄洛替尼(爱必妥)[5]同时以ErbB为靶点的治疗还可提高肿瘤细胞对传统放疗及化疗的敏感性[67]然而在胃癌治疗方面至今仍未获得特异性的靶向分子 　　先前的研究发现，环氧合酶2(COX2)在胃癌等人类多种肿瘤中呈过表达[810]动物实验也已证实肿瘤的快速生长需要COX2的参与，而增加COX2的表达可促进乳腺肿瘤的生长[1112]在息肉易感鼠模型中敲除COX2基因可阻碍肿瘤的生长[13]； COX2的选择性抑制剂在致癌物诱发胃癌的动物模型中可阻碍肿瘤的进展[14]；用反义cDNA或siRNA抑制COX2同样可阻碍胃癌的生长[15]。

上述实验结果均提示，抑制COX2有助于肿瘤的防治[1617]其机制目前普遍认为与诱导肿瘤细胞凋亡有关此外，近期有研究显示其作用还可能是通过抑制血管生成及阻断钾离子通道实现的研究者用反义COX2和COX2抑制剂处理细胞，再从中获取条件培养基用于体外试验，结果显示该培养基可抑制HUVEC细胞的增殖、迁移和管状形成能力，并在体内抑制肿瘤的血管生成[18]实验还发现在胃癌中COX2的表达与VEGF的水平及微血管密度(MVD)密切相关[1921]，COX2的过表达可引起胃癌细胞中前列腺素E2(PGE2)、血管生成素(Ang)及血管内皮生长因子(VEGF)的上调[22]另一方面，钾离子通道在众多生理反应中扮演重要角色[23]人类etherαgogo相关基因(HERG)编码延迟整流钾离子通道的亚基，有研究发现它可能与肿瘤细胞的存活有关[24]另有研究证实HERG蛋白参与了胃癌的发生，并与肿瘤分化程度、TNM分级及淋巴结转移有一定的相关性对COX2抑制作用的最新机制研究显示，COX2可能介导PGE2的合成增加其与受体的结合，继而活化胃癌细胞中的cAMP；cAMP水平的增高促进了其与HERG蛋白的结合，从而实现对HERG电流的调节[25]。

　　此外，利用双向电泳(2DE)及基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDITOF MS)等高通量分析技术，研究者还筛选出了其他一些受COX2调节的蛋白15羟基前列腺素脱氢酶[NAD+](15PGDH)是前列腺素降解的关键酶，在转染了COX2 siRNA质粒的SGC7901细胞中发现该酶的表达上调[26]体内经COX2介导合成的前列腺素的水平(尤其是PGE2)不仅与其合成过程有关，还取决于其分解速度[27]15PGDH可催化15羟基前列腺素转化为活性较弱的15酮基前列腺素[28]，结合其在某些肿瘤组织中表达下调甚至缺失的现象，人们推测其可能作为一种潜在的抑癌基因在部分肿瘤的发生与发展过程中起着重要的作用[2931]我们实验室发现，15PGDH在胃癌组织中的表达下降，同时COX2的表达上升；且15PGDH与胃癌的分化、TNM分级及淋巴结转移之间存在显著的负相关关系进而通过Western blot及免疫细胞化学研究发现，在细胞系中用siRNA抑制COX2可使15PGDH的表达上调(128.57%)；而用COX2的cDNA转染胃癌细胞可在上调COX2表达的同时下调15PGDH(51.72%)[26]。

以上结果提示在人胃癌中15PGDH 可被COX2下调，从而促进了肿瘤的发生与发展 　　RUNX3目前被视为一个潜在的抑癌基因，其缺乏可能导致胃癌的发生[32]在原发性胃癌患者中有60%存在RUNX3表达降低，而在晚期转移癌患者中则多达90%这部分患者可能因RUNX3基因的杂合子丢失或启动子甲基化而导致RUNX3的表达不足，其后果是显著缩短了患者的生存时间实验室研究发现RUNX3基因敲除鼠的胃黏膜细胞表现出恶性转化的特征[32]，而重新激活RUNX3可抑制胃癌细胞的增殖及成瘤性我们实验室发现，RUNX3在胃转移癌中低表达，而上调RUNX3的表达可抑制荷瘤裸鼠的肿瘤血管生成此外，通过转染RUNX3的真核表达载体上调肿瘤细胞的RUNX3表达，可使该细胞体内外侵袭能力显著下降进一步探讨其机制发现，RUNX3的上述抑瘤作用可能是通过在转录水平上调基质金属蛋白酶组织抑制因子1(TIMP1)的表达进而抑制基质金属蛋白酶9(MMP9)的活性而实现的我们的研究还发现，RUNX3与肿瘤细胞对化疗药物的敏感性有关，用RUNX3特异性siRNA抑制RUNX3的表达可使胃癌细胞对化疗药物产生耐药性，而转染RUNX3真核表达载体可使胃癌细胞对阿霉素等多种化疗药物的敏感性增高。

其机制可能是过表达的RUNX3与Bcl2、MDR1和MRP1等基因的启动子序列结合，抑制了启动子活性，下调了这3种蛋白在胃癌细胞中的表达，从而增加了细胞对化疗药物的敏感性[33]这些结果为我们提示了RUNX3抑制胃癌转移及提高胃癌化疗敏感性的一条新通路，为未来RUNX3在胃癌治疗中的临床应用提供了实验依据　　2 调整肿瘤微环境 肿瘤细胞必须从微环境中获取足够的氧气及各种营养因子以维持自身的代谢与生存[34]1～2mm3的小瘤结节可直接通过弥散作用获取养分，而后续的生长则需依赖肿瘤血管的生成[3536]事实上肿瘤的发生、发展以及转移均与肿瘤的血管生成密切相关，肿瘤血管抑制治疗已成为新的肿瘤治疗研究热点 血管生成是一个复杂的过程，由多种活化因子与抑制因子共同作用，调节内皮细胞的增殖、迁移、管状形成及血管稳定[34]VEGF和Ang是其中最重要的两个因子VEGF及其受体(VEGFR)的主要作用是促进新血管的生成，而Ang1/Tie2则主要促进新生血管的重塑与成熟[37]近几十年来基于以上理论发展出的血管靶向疗法为肿瘤治疗打开了一扇新的大门研究发现Ang1、2在人胃癌中高表达[38]；利用反义Ang1可抑制胃癌的生长及血管生成[39]，而COX2抑制剂则可通过抑制缺氧情况下Ang2的上调从而抑制其介导的胃癌血管生成及肿瘤生长[40]。

骨桥蛋白(OPN)是应激、炎症、损伤修复及免疫反应等状态下产生的一种分泌型蛋白，已有研究证实其与COX2及VEGF之间存在正相关关系，3种蛋白的表达水平均与胃癌的TNM分级、淋巴结转移和远处转移以及MVD显著相关调查发现高MVD胃癌患者的生存期较低MVD患者明显缩短[41]，而用RNA干扰技术抑制OPN的表达则可抑制肿瘤的生长及血管生成[42]提示OPN、COX2和VEGF有协同促进肿瘤血管生成及肿瘤转移的作用，因而有望成为肿瘤血管抑制治疗的新靶点 另一方面，由于肿瘤血管与正常血管相比存在异质性，近年来已有大量的研究人员致力于寻找肿瘤血管内皮细胞的特异性分子，并将其作为抗肿瘤治疗的新靶标遗憾的是在胃癌研究中尚未筛选出这种特异性标志物，这可能与胃癌微血管内皮细胞不易培养及细胞特异性分子表达水平低有关噬菌体呈现肽库技术的开发为筛选低浓度的特异性分子提供了有效的技术支持，利用这一技术我们通过体内筛选获得了一条具有胃癌血管靶向性的噬菌体呈现肽CGNSNPKSC(GX1)[43]体内外实验已证实该短肽除具有血管靶向性外还可促进肿瘤血管内皮细胞凋亡，阻碍细胞增殖及新血管的生成在此基础上我们构建并表达了GX1与重组人肿瘤坏死因子(rmhTNFα)的融合蛋白GX1rmhTNFα。

将该融合蛋白注入荷瘤裸鼠体内，可见其特异性结合于肿瘤血管，与单纯应用rmhTNFα相比，该融合蛋白能更有效地抑制肿瘤的生长，并可降低全身毒副作用提示GX1短肽在胃癌的靶向性生物治疗中具有良好的应用前景[44]同时，我们利用99Tcm直接标记法获得核素标记肽99TcmGX1，将该肽注入荷瘤裸鼠体内，ECT显像结果显示，GX1具有良好的体内肿瘤组织靶向性及影像学肿瘤标志物的特征[45]目前，该短肽的受体筛选正在进行，这将有助于GX1在血管生成领域得到更广泛的应用　　3 免疫治疗　　免疫治疗一直是肿瘤辅助治疗的重要组成部分，它分为抗原特异性及非特异性两大类非特异性免疫治疗在临床中的应用，一方面集中于利用细菌或其组份增强患者自身的非特异性免疫应答，以达到抗肿瘤的疗效例如将卡介苗(BCG)直接注入膀胱内治疗浅表性膀胱癌[46]但由于其疗效有限且毒副作用明显，继而引发了对CpG寡聚脱氧核苷酸等遗传修饰细菌制剂的探索另一方面，各种重组细胞因子也在抗肿瘤免疫治疗中占有重要的地位，如α、β、γ干扰素、肿瘤坏死因子α、白介素2、4、6、12及粒细胞单核细胞集落刺激因子等其中α干扰素用于慢性髓性白血病和毛细胞性白血病已收到一定疗效。

　　在抗原特异性抗肿瘤免疫治疗方面，随着人们对抗肿瘤免疫应答及肿瘤免疫耐受现象的分子基础的了解不断加深，以及各种肿瘤特异性抗原(TA)的获取，一套以T细胞为基础的抗肿瘤免疫治疗已逐渐进入临床，并取得了可喜的成效这其中主要包括肿瘤疫苗的应用、肿瘤特异性T细胞及其受体的过继免疫治疗和异体干细胞及异体效应淋巴细胞的移植等这些成果在某种程度上已使肿瘤免疫治疗成为了继外科手术、放疗及化疗后的第4种抗肿瘤治疗策略上世纪90年代大量TA的发现和固相酶联免疫斑点技术(ELISPOT)及四聚体技术的发展为肿瘤预防性疫苗的研制提供了有效的支持[47]在此基础上研究者们相继研制出多种类型的抗肿瘤疫苗，如TA疫苗、mRNA疫苗及DNA疫苗等其中针对人乳头瘤病毒16(HPV16)的疫苗经双盲实验证实，能有效地预防HPV16的感染及HPV16相关性宫颈上皮内瘤(CIN)的发生[48] 然而在胃癌中特异性或相关性抗原的缺乏限制了这一治疗的应用我们实验室早期发现的胃癌特异性MG7抗原已被证实可有效地改善胃癌的早期诊断，并介导抗肿瘤免疫反应MG7的抗原决定簇位于糖链上，现已通过噬菌体呈现肽库技术筛选并合成了一系列MG7抗原表位模拟肽[4950]。

受体竞争结合实验证实这些模拟肽具有良好的抗原模拟效果，可为发展肿瘤疫苗提供有效的帮助在此基础上，我们已通过多种方式构建了相关肿瘤疫苗，包括融合了热休克蛋白70的DNA疫苗[51]、含4个模拟表位的DNA疫苗[52]及MG7抗原肽与佐剂CpG寡聚脱氧核苷酸共包封制备的纳米疫苗[53]等其中多表位的MG7抗原纳米疫苗可诱导较强的细胞免疫应答，并已在荷瘤裸鼠体内表现出明显的抗肿瘤效应胃癌免疫治疗的另一进展是利用HLAA匹配的同种异体胃癌细胞诱导产生肿瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTLs)研究证明，早期胃癌患者诱导产生的CTLs比晚期患者的CTLs具有更强的抗肿瘤作用HLAA匹配的同种异体胃癌细胞可诱导胃癌患者及健康人群的外周血淋巴细胞(PBLs)分化产生CTLs并进一步扩增这类经流式细胞仪分析证实为CD3及CD8阳性的CTLs可通过介导细胞毒效应，有效地杀伤HLAA2或HLAA24胃癌细胞[54]这一研究进展提示，我们可利用HLAA匹配的肿瘤细胞诱导健康人群的PBLs分化为CTLs，产生肿瘤特异性细胞毒效应，进而实现抗肿瘤免疫治疗　　4 存在的问题与展望 虽然肿瘤的分子靶向治疗已经取得了令人瞩目的成果，但其临床应用仍存在很多问题。

例如，部分抗肿瘤疫苗在临床应用中不能有效地激发宿主的免疫应答，其原因可能是多方面的，包括TA的选择不合适、肿瘤组织TA的缺失或修饰、肿瘤细胞分泌的免疫抑制性细胞因子等面对这些问题，如何更有效地筛选肿瘤特异性靶向分子，如何通过免疫佐剂的应用等方法解决现有的靶向性蛋白耐药性的问题等等将是未来抗肿瘤靶向性治疗必须解决的问题另一方面，目前大部分靶向药物的临床有效率都在10%左右，这可能是由于肿瘤的发生发展是一个受多环节调控的复杂过程，单独控制其中的某个靶点难于收到显著疗效以胃癌的发生发展为例，就可能受到VEGF、RUNX3、OPN、COX2等多重因素的共同调控，它们之间相互联系，建立起一个复杂的信号传导网，通过交叉对话使上游发起的信号转化为下游的级联反应，最终达到效应性结果因此，未来的研究趋势必将是多管齐下，通过多分子多靶向联合治疗提高抗肿瘤治疗的效率相信随着人们对肿瘤发生发展的分子基础的了解不断深入，肿瘤的治疗必将揭开崭新的一页参考文献】 　　[1]PARKIN DM, BRAY F, FERLAY J, et al. Global cancer statistics 2002 [J]. CA Cancer J Clin, 2005, 55(2):74108.　　[2]LEUNG WK, WU MS, KAKUGAWA Y, et al. Screening for gastric cancer in Asia: current evidence and practice [J]. Lancet Oncol, 2008, 9(3):279287.　　[3]MUFSON RA. Tumor antigen targets and tumor immunotherapy [J]. Front Biosci, 2006, 11:337343.　　[4]DRUKER BJ, TAMURA S, BUCHDUNGER E, et al. Effects of a selective inhibitor of the Abl tyrosine kinase on the growth of BcrAbl positive cells [J]. Nat Med, 1996, 2(5):561566.　　[5]YARDEN Y, SLIWKOWSKI MX. 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