新城疫冻干疫苗生产工艺流程1生产用毒种制备11毒种繁殖 将毒种用灭菌生理盐水作适当稀释（如10-4或10—5）,尿囊腔内接种10日 龄SPF鸡胚，每胚0.1ml选接种后72~120小时死亡、且病痕明显的鸡胚，分别收获鸡胚液（尿 囊液及羊水），装于灭菌容器内将检验无菌、且对1%鸡红细胞凝集价＞1： 640（微量法1： 512）的鸡胚液混合，定量分装于安甑中，冷冻保存注明收获日期，毒种代数等.12毒种鉴定1.2.1病毒含量按含毒鸡胚液量用灭菌生理盐水作为10倍系列稀释，取10-7、10-8、10—9 3个稀释度各尿囊腔内接种10日SPF鸡胚5个，每胚0.1ml,置36〜37°C继续孵育,48小时以 前死亡的鸡胚弃去不计，在48~120小时死亡的鸡胚随时取出，收获鸡胚液，同一稀释度 的胚液等量混合，按稀释度分别测定红细胞凝集价，至120小时，取出所有活胚，逐个收获 鸡胚液，分别测定红细胞凝集价，凝集价＞1:160 （微量法1:128）者判为感染，计算EID50，每0 1ml病毒含量应＞108EID501.2.2纯净应无细菌、霉菌、支原体和外源病毒污染,分别按《无菌检验或纯粹检验标准 操作规程》、《支原体检验标准操作规程》、《外源病毒检验标准操作规程》进行。
13毒种保存 在—15C以下保存，应不超过1年.14毒种继代 应不超过3代.2制苗材料选择 选择发育良好的9~11日龄SPF鸡胚作为制苗材料3制苗用毒液的制备31接种 取生产用毒种用灭菌生理盐水作适当稀释（如10—4或10—5），每胚尿囊腔内接种 01ml，接种后密封针孔，置36〜37C继续孵育，不必翻蛋3.2孵育和观察 鸡胚接种后，每日照蛋一次，将在60小时前死亡的鸡胚弃去60小时后, 每4~8小时照蛋一次，死亡的鸡胚随时取出，直至96或120小时,不论死亡与否，全部取出，气室 向上直立，置于2〜8C冷却3.3收获 将冷却4~24小时的鸡胚取出，用碘酊消毒气室部位,然后以无菌手术剥除气室部 卵壳，剪开尿囊膜，吸鸡胚液，每若干个鸡胚的胚液混合为一组收获后的胚液置于灭菌瓶 中，作好标识，留样后，结冻保存在收获胚液的同时，应逐个检查鸡胚，如胎儿腐败、胚液混浊及有任何污染可疑者弃 去不用4半成品检验 4.1无菌检验 经处理过的胚液,每组分别取样，按《无菌检验或纯粹检验标准操作规程》进 行无菌检验，应无细菌生长.42病毒含量测定按含毒鸡胚液量用灭菌生理盐水作为10倍系列稀释，取10—7、10—8、10—9 3个稀释度各尿 囊腔内接种10日SPF鸡胚5个，每胚0.1ml,置36〜37°C继续孵育，48小时以前死亡的鸡胚 弃去不计，在48~120小时死亡的鸡胚随时取出，收获鸡胚液，同一稀释度的胚液等量混合， 按稀释度分别测定红细胞凝集价，至120小时，取出所有活胚，逐个收获鸡胚液，分别测定 红细胞凝集价，凝集价＞1： 160 （微量法1： 128）者判为感染，计算EID50,每0.1ml病毒含 量〉107EID50者可用于配制疫苗。
5配苗及分装将检验合格的若干组鸡胚液滤过,混合于同一容器内,按规定羽份,加一定比例的蔗糖脱 脂奶粉作稳定剂,使其最终蔗糖含量为25%，脱脂奶粉含量为5%，同时加入适宜的抗生 素，充分摇匀，定量分装，每羽份病毒含量应＞106EID50分装后迅速进行冷冻真空干燥6成品检验6.1物理性状6.1.1外观检查疫苗瓶上的标签,打印出的羽份或头份、生产批号、有效日期清晰可见、 位置适当瓶上的铝盖稳固不松动.61.2眼观检查 将疫苗拿到与眼平行位置观察呈微黄色，海绵状疏松团块，然后再轻微振 动，疫苗松动并与瓶壁分离，判为合格6.1.3溶解性检查用稀释液注射到疫苗瓶内,经轻微振动,疫苗应迅速完全溶解，无粘块或 粘团出现，判为溶解性良好2无菌检验 按《无菌检验或纯粹检验标准操作规程》进行，如有菌生长，应进行杂 菌计数，并作病原性鉴定（按《杂菌计数和病原性鉴定操作细则》进行）和禽沙门氏菌检验 每羽份非病原菌数应不超过1个（按《禽沙门氏菌检验法》进行）3支原体检验 按《支原体检验法》进行，应无支原体生长.6.4 鉴别检验6.4 1选择发育良好的10日龄SPF鸡胚10只，划出尿囊腔接种部位 2将疫苗用无菌生理盐水稀释至105o0EID50/0.1mL，与等量抗鸡新城疫病毒特异性血清混合，室温中和1小时后，尿囊腔接种，每胚0。
1mL3将接种后鸡胚用石蜡封孔后，置37C继续孵育，观察120小时，在24〜120小时 内应不引起特异死亡，且至少存活8只，鸡胚液作红细胞凝集试验，应为阴性.6.5外源病毒检验 按《外源病毒检验法》进行.6.6安全检验下列方法任择其一6.1用鸡胚检验 将疫苗用无菌生理盐水稀释，尿囊腔内接种10日龄鸡胚10只，每胚 0.1ml （含10个使用剂量），接种后24~72小时，鸡胚死亡率应不超过20%为合格如死亡 率超过20%，可用20个鸡胚重检1次，重检结果死亡率仍超过20%,该批疫苗判为不合格6.6.2用鸡检验 用2〜7日龄SPF雏鸡20只，合成两组，第1组10只，每只滴鼻接种0.05mL （10个使用剂量）；第2组10只，不接种作为对照,两组在相同条件下分别饲养管理，观察10 日,应无不良反应如有非特异性死亡，免疫组与对照组均不超过1只6.7效力检验下列方法任择其一.61用鸡胚检验6.7.1 1鸡胚选择 选择发育良好的10日龄SPF鸡胚15个，划出尿囊腔接种部位，作出批 组及滴度标记，每一滴度接种5个6.7.1.2疫苗稀释 将疫苗按瓶签注明羽份，用灭菌生理盐水稀释至1羽份/0.1mL，再作10 倍系列稀释至10-7.6.7.1.3接种 分别取10-7、10-6、10-5三个稀释度尿囊腔内接种鸡胚各5个，每胚0.1mL， 用石蜡封孔.6。
71.4孵育 置37°C继续孵育至120小时，每天上、下午各照检1次，48小时以前死 亡的鸡胚弃去不计，在48~120小时死亡的鸡胚，随时取出放在2〜8C冰箱中，至120小时取 出全部活胚放在2〜8CC冰箱中24小时1.5凝集价（HA）测定与计算鸡胚半数感染量（EID50） 将冷却鸡胚取出，将同一稀 释度的死亡鸡胚液等量混合，分别测定红细胞凝集价；将活胚逐个收获鸡胚液，分别测定红 细胞凝集价，HA>160 （微量法128）者判为感染，计算半数感染量，每羽修106°5EID50（国 家标准每羽份>1@0EID50），判为合格7.2 用鸡检验61鸡的选择 选取30—60日龄健康易感鸡（血凝集抑制价应M4）10只2.2疫苗稀释 将疫苗按瓶签注明羽份，用灭菌生理盐水稀释成每0.05mL含1/100使 用剂量6.7.2 3免疫及攻毒 每只鸡滴鼻接种0.05mL，10~14日后，连同条件相同的对照鸡3只， 各肌肉注射鸡新城疫北京株强毒104〜ELD50，观察10-14日，对照鸡全部发病死亡,免疫鸡 至少保护9只为合格6.8剩余水分测定 按《剩余水分测定方法》进行，应符合规定9真空度测定 按《真空度测定方法》进行，应符合规定。
■.无菌检验,:':照蛋时间病毒含•量".，冷蛋时间::冷蛋温度纯化水洗干燥.，物理性状，，・■:安全检验」.'无菌检验，,外源病毒检验*脉动蒸汽灭菌种蛋消毒SPF种胚后孵化及照蛋,，培养温湿'度.铝盖纯化水粗洗-15°C冷冻保存无菌检验,’.分装F加塞F冻干r出箱1r压盖1r贴签新城疫灭活疫苗生产工艺流程1生产用毒种制备11毒种繁殖 将毒种用灭活生理盐水作适当稀释（如10-4或10—5）,尿囊腔内接种10 日龄SPF鸡胚，每胚0.1ml选接种后72〜120小时之间死亡且病痕明显的鸡胚，分别收获鸡 胚液（尿囊液及羊水），装于灭菌容器内将检验无菌，且对1%鸡红细胞凝集价在1： 640（微 量法1： 512）以上的鸡胚液混合，定量分装于安甑瓶中，冷冻保存注明收获日期、毒种 代次等1.2 毒种鉴定1.2.1病毒含量 按含毒鸡胚液量用灭菌生理盐水作为10倍系列稀释，取10-7、10—8、10—9 3个稀释度各尿囊腔内接种10日SPF鸡胚5个，每胚01ml，置36〜37°C继续孵育，48小时 以前死亡的鸡胚弃去不计，在48~120小时死亡的鸡胚随时取出，收获鸡胚液，同一稀释度 的胚液等量混合，按稀释度分别测定红细胞凝集价，至120小时,取出所有活胚，逐个收获 鸡胚液，分别测定红细胞凝集价，凝集价＞1:160 （微量法1:128）者判为感染，计算EID50,每0.1ml 病毒含量应＞108EID50.1.3毒种保存 在一15C以下保存，应不超过6个月。
1.4毒种继代 应不超过3代2制苗材料选择 选择发育良好9〜10日龄的易感鸡胚作为制苗材料.3制苗用毒液的制备3.1接种 取生产用毒种，用灭菌生理盐水作适当稀释（如10—4或10—5），每胚尿囊内接 种0.1ml，接种后密封针孔，置36〜37C继续孵育，不必翻蛋3.2孵育和观察鸡胚接种后，每日照蛋1次，将60小时前死亡的鸡胚弃去此后，每4〜6 小时照蛋1次,死亡的鸡胚随时取出，直至96小时，不论死亡与否，全部取出，气室向上直立， 置于2〜8C冷却4〜24小时.33 收获3.31鸡胚液的收获将冷却的鸡胚取出，用碘酊消毒气室部位，然后以无菌手术破除气室 部卵壳，揭去卵壳膜，剪破绒毛尿囊膜及羊膜（谨防卵黄破裂），吸取胚液对每个鸡胚在 吸取胚液前均应注意检查，凡胎儿腐败、胚液混浊及有任何污染可疑者•，弃去不用.死胚和活胚分别收获，每若干个鸡胚分为一组，吸取胚液放于同一灭菌的容器内，每组 抽样测定血凝价，血凝价低于1： 160（微量法1： 128）者应弃去同时作无菌检查，应无细 菌生长收获的胚液灭活前在2〜8C左右保存，应不超过5日2鸡胚胎儿收获及浸出液的制备 在收获及胚液的同时，取病变胎儿，去头、脚， 用生理盐水洗2〜3次，磨碎，制成（1： 5）〜（1： 10）乳剂,加适宜的抗生素适量，然后离 心或以4层纱布一层铜纱网滤过，置自然沉淀1~2日，然后取样作无菌检查。
以上清夜作为 配制双相油乳剂疫苗用4灭活 将上述无菌胚液以4层纱布及一层细铜纱网滤过，混合于一个大玻璃瓶内,吸出数 毫升样品备测毒价其余胚液和鸡胚浸出液分别计量加入10%甲醛溶液，随加随摇，使其能充 分混合，甲醛溶液的最终浓度为0加甲醛溶液后最好倾倒另一瓶中，以避免瓶口附近 黏附的病毒未能接触灭活剂然后在37r灭活16小时（以瓶内温度达到37r开始计时）期 间振摇3~4次在2〜8r保存，应不超过1个月5半成品检验5.1无菌检验 取灭活的胚液及鸡胚浸出液分别按附录448进行,应无菌生长 2灭活检验 取10日龄无新城疫病毒抗体的鸡胚6个，每个接种灭活胚液0.23ml，每日 照蛋2次，观察5日，鸡胚非特异死亡不应超过1个对所有胚液分别测定血凝价,应不出 现血凝，认为灭活完全.如有可疑，应将可疑胚液进行重检，重检不合格者报废.鸡胚浸出液 也按照上述方法检查.5.3毒价测定 将灭活前取出的胚液进行10倍系列稀释，取10-7、10-8、10—93个稀释度分 别接种9〜10日龄无鸡新城疫病毒抗体的鸡胚5个，每胚尿囊内01ml，每日照蛋2次， 观察5日，无论死胚、活胚均应测定血凝价，血凝价〉1:80 （微量法1： 64）以上者，判为感 染，计算EID50，每0.1ml病毒含量＞108 EID50，方可用于制苗。
6单相油乳剂灭活疫苗制备6 1油相制备 取注射用白油94份，加司本-80 6份，混合后，加硬脂酸铝2份,随加随 搅拌至透明为止，高压灭菌备用.6.2水相制备取吐温一80 4份装入带玻璃珠的瓶中灭菌，冷却后加灭活胚液96份，充 分振瑶使吐温—80完全溶解为止 3乳化 取油相3份放于乳化罐内，开动电机慢速转动搅拌，同时徐徐加入水相1份， 加完后再以10000r/min搅拌2〜5分钟,在终止搅拌前加入1 %硫柳汞溶液，使其最终浓度为 0.01 %乳化后，取3~5ml以3000r/min离心15分钟，若有分层现，应重复搅拌1次.7 双相油乳剂疫苗制备7 1 用乳化罐乳化71水相、油相制备同单相苗，但水相制备中，鸡胚液是按4%加入吐温，而鸡胚浸 出液则按6%加吐温1.2取油相2份放入乳化罐内，开动电机慢速转动搅拌，同时徐徐加入胚液1份，加完 后再以10000r/min搅拌3取鸡胚浸出液（单相苗鸡胚液等量）放于乳化罐，开动电机缓缓加入上述油包水单 相苗，加完后再以10000r/min搅拌2~5分钟，在终止搅拌前加入1%硫柳汞溶液，使最终浓 度为0.01乳化后取3~5ml以3000r/min离心10分钟，若分层严重应再搅拌1次.7.2用乳化罐乳化.8分装定量分装，加盖密封。
9成品检验91物理性状91外观为乳白色乳剂9.1.2剂型单相苗为油包水型.取一清洁吸管，吸取少量疫苗滴于冷水中，应呈油滴状不扩 散双相苗为水包油包水型，滴于冷水中，应呈云雾状扩散 3稳定性 在37^左右条件下放置21日，应不破乳 4粘度 用1ml吸管（出口内径12mm），吸取25°C左右的疫苗1ml，令其垂直自然流出，记录流出0.4ml所需时间单相苗在8秒以内,双相苗在5秒以内为合格.9.2无菌检验 按《无菌检验或纯粹检验标准操作规程》进行,应无菌生长3安全检验 用30~60日龄健康易感鸡（HI抗体＜1:4） 6只，各肌肉或颈部皮下注射疫 苗1ml，观察14日，应不出现由疫苗引起的任何局部和全身不良反应4效力检验 用30〜60日龄健康易感鸡（HI抗体＜1： 4） 15只，其中10只各皮下或 肌肉注射疫苗20gl （用05ml以下的注射器注射），另5只不免疫作对照，21〜28日后，连 同条件相同的对照鸡5只，各肌肉注射105ELD50强毒，观察14日，对照组全部死亡，免疫 组至少保护7只为合格9.5甲醛含量测定 按《甲醛含量测定法》进行，应符合《制品检验的有关规定》鸡新城疫灭活疫苗生产工艺流程图、主要过程控制点和控制项目种蛋消毒前孵化冷蛋时间，铝盖分装瓶胶塞*非免疫种蛋*油相制备*水相制备'"种蛋选择":照蛋时间n.-培养温湿度.冷蛋温度":安全检验：:效力检验；＜-f*:分装前、:中、后无点-.■硫柳汞含量测定.■.-15 °C冷冻保存.二接种剂量,，,*后孵化及照蛋.二接种途径,■，*接种甲醛含量测定.*:无相应抗体:物理性状:*脉动蒸汽灭菌*检验*乳化*贴签压盖加塞*分装*装箱入库* . ■.无菌检验,',毒价测定:*冷蛋清洗清洗清洗*灭菌*灭菌*:灭活检验:抽样收获*灭活附录1。
剩余水份测定法1技术依据及原理卡氏法是利用卡氏试剂中的碘和二氧化硫在砒啶和甲醇溶液中能与水起定量反应的原理，从而测定水份2材料、仪器、试剂的准备及基本要求2.1仪器及设备电子分析天平（精度0.1mg，称量范围0〜110g）,费休水份滴定仪（梅特勒DL31）.2.2 试剂卡氏试剂、无水甲醇，纯水 3检验器具止血钳（开启苗瓶），玻璃棒（或能捣碎检品的器具），10ul注射器，烧杯 4样品每批疫苗4个样品2.5其它检验记录纸、笔、纱布和汗布手套3 检验步骤3 1接通电源、打开费休水份滴定仪（梅特勒DL31）主机、打印机、天平开关.3.2按滴定仪的RUN键滴定仪自动滴定至终点3滴定仪屏幕显示待机模式Drift值在25以下指示箭头稳定…（平指）时，开始滴定标定滴度：3.31 按F2键至显示屏出现H2O ISO 369632 连续按 F3 键至显示屏出现 please add sample 0.0100 gvapprox〉3.3.3天平去皮,通过进样孔注入已称重的纯水，（用10m注射器抽取10m纯水置天平称重）注射器放回天平后按F3；3.3.4按F1自动输入样品量；35 按F2显示样品重量；33.6按F3确认样品重量；3。
3.7滴定至终点自动打印出结果，打印结束按F3返回到待机模式；38重复标定只需依上述第1条开始同法操作4水份测定：31将样品置天平称重32 连续按 F3 键，显示屏出现 please add sample 0.0000g〜5000g；3.4 3天平去皮后通过进样口将已称重的样品加入滴定杯中，将载样杯放回天平4按F3预滴定34.5按F1自动输入样品量36按F2显示样品重量34.7按F3确认样品重量3.4 8滴定至终点自动打印出结果，打印结束，按F3返回到待机模式3.4 9测定下一个样品只需依上述41开始，同法操作4记录与计算5结果判定每瓶样品含水量不得超过40%，如有超过时，可重检一次2. 真空度测定法1技术依据及原理依据《兽用生物制品质量标准》附录中的真空度测定法，即使用高频火花真空测定器测 定它的基本原理是利用本仪器振动形成火花束，激励谐振荡回路，使次线线圈感应出高频 高压脉冲电压，使被检物产生不同颜色的辉光，根据颜色的变化来判断疫苗的真空度2 注意事项2.1按照规定要求，在检验过程中至少要有一名检验员和一名复核员共同进行，确保检验结 果的准确性2.2检验要在光线较暗的操作室里进行，便于结果判定的准确性。
2 3被检样品从冷库中取出应擦干瓶壁上的水份，样品达到室温后再进行测定3材料、仪器、试剂的准备及基本要求3 1仪器及设备电火花真空检测器2样品 所有被检样品3.3检验记录纸、笔.4检验步骤4.1取待检样品，一字排列于暗室的操作台上，使瓶与瓶之间有一定距离2将真空检测器尾部电源插头插入220V电源插座里3将放电簧头对准被检样品（簧头不要触到瓶壁），打开开关，间歇适用（时开时关） 4观察并记录逐瓶样品的真空状态5安全措施5.1使用真空检测器时，人体不要接近仪器的头部电簧,以免高频电流的电击，（但没有生命 危险）5.2测定样品真空时，检测器必须缓慢移动，放电簧不应在一点停留时间过长，以免把玻璃 击穿，影响样品本身的效果.5 3测定样品真空时，注意远离疫苗瓶上的金属帽，否则会造成错误信号，甚至在金属处 将玻璃击穿而造成漏洞.6结果判定如果容器内出现白色、粉色或紫色辉光,则真空度检查合格3. 无菌检验和纯粹检验1技术依据及原理：生物制品（除另有规定者外）都不应有外源微生物污染灭活疫苗不得含有活的本菌或本 毒各类生物制品必须按规定作无菌检验或纯粹检验，全部操作应在无菌条件下进行2注意事项21抽样后逐瓶检查包装、胶塞、瓶签有无破损和毁坏，瓶内有无杂质。
2 2为防止交叉污染，一个样品用一个吸管或一个注射器2.3各类生物制品的检验操作应在无菌条件下进行2.4检验过程要仔细、认真2.5保持实验室的清洁卫生，严格遵守常规的消毒制度3材料、仪器、试剂的准备及基本要求3 1 仪器24〜26°C、36〜38°C温箱，检验器具，试管架,10ml、5ml、1ml吸管,记号笔，记录纸3.2检验用培养基32.1 无菌检验厌氧性及需氧性细菌的检验用含硫乙醇酸盐培养基（简称TG）和酪胨琼脂培养基（简称G.A）霉菌及腐生菌检验用葡萄糖蛋白胨汤（简称GP）.3.2.2纯粹检验用适宜本菌生长的培养基4检验步骤4.1抽样应随机取样并注意代表性1制造疫苗用的各种原菌液、毒液和其它配苗组织乳剂、稳定剂及半成品的无菌或 纯粹检验，应每瓶（罐）分别抽样进行，抽样量为2〜10ml4.1.2成品的无菌或纯粹检验应按每批或每个亚批进行，每批按瓶数百分之一抽样，但不应 少于5瓶，最多不超过10瓶，分别进行检验2 检验用培养基42.1 无菌检验41.1厌氧性及需氧性细菌的检验 用硫乙醇酸盐培养基（T.G）及酪胨琼脂（GA）.4.2.1.2霉菌及腐生菌检验用葡萄糖蛋白胨汤（G.P）.4。
2.2活菌纯粹检验用适于本菌生长的培养基.4.2 3灭活检验 用适于本菌生长的培养基，或对本毒敏感的细胞、组织和动物4杂菌计数 用马丁琼脂或GA培养基2.5病原性鉴定 用TG培养基或其他适宜培养基.43检验方法及结果判定4.3 1细菌原菌液及活菌苗半成品的纯粹检验取样接种TG小管及适宜于本菌生长的 其他培养基斜面各2支，每支0.2ml，1支置37°C培养;1支置25°C培养，观察3〜5日，应纯 粹.4.3 2病毒原毒液和其它配苗组织乳剂、稳定剂及半成品的无菌检验 取样接种T.G小管 及GA斜面各2支，每支02m1,1支置37C培养；1支置25C培养，观察3~5日,应无菌 生长 3灭活检验 细菌灭活后，用适于本菌生长的培养基2支，各接种0.2ml，置37C培 养5日，应无菌生长病毒液灭活后和细菌毒素脱毒后接种对本毒敏感的细胞、禽胚或实验 动物，应正常4.3.4含甲醛、苯酚、汞类等防腐剂和抗生素的制品 用TG培养基50ml，接种样品（冻 干制品先做10倍稀释）1ml，置37C培养，3日后自小瓶中吸取培养物分别接种T.G小 管和GA斜面各2支，每支02m1,1支置37C； 1支置25C，另取0.2ml，接种1支G。
P小管置25C，均培养5日，应无菌生长如制品允许含一定数量非病原菌，应进一步作杂菌计数和病原性鉴定5细菌性活疫苗（冻干制品恢复原量）及不含防腐剂、抗生素的其它制品或稀释液， 将样品直接接种To G小管、GA斜面或适于本菌生长的其他培养基各2支，每支0.2m1, 1支置37°C； 1支置25°C，另用1支G.P小管，接种02m1置25°C,均培养5日.细菌性活 疫苗应纯粹，其他制品应无菌生长4.3.6血液制品和混浊制品如不加防腐剂或抗生素，可直接用不加琼脂的TG小管和G.A 斜面,接种量、培养条件、时间和判定标准同4如加防腐剂或抗生素，检验方法 和判定同37如培养后混浊不易判定时,可移植l次，再判定 3.8每批抽检的样品必须全部无菌或纯粹生长如发现个别瓶有杂菌或结果可疑时，可重 检原瓶（如为安甑或冻干制品，可重抽样品），如无菌或无杂菌生长，可作无菌或纯粹通过 如仍有杂菌,可抽取加倍数量的样品重检，个别瓶仍有杂菌，则作为污染杂菌处理5安全措施5.1检验过程中注意防止对检验人员和环境的污染 2检验人员必须穿戴工作服和口罩3滴撒在操作台、地面的异物要进行消毒处理.5.4检验完毕后开封的检品均要经过高压灭菌处理。
6记录和计算检品在接种相关培养基后，每天观察温箱内的培养情况并记录观察结4. 杂菌计数1技术依据及原理某些疫（菌）苗允许有一定数量的非病原性杂菌，但这类制品如污染杂菌，必须作杂菌 计数2 注意事项2.1为防止交叉污染，一个样品用一个吸管或一个注射器2.2各类生物制品的检验操作应在无菌条件下进行2.3检验过程要仔细、认真.3材料、仪器、试剂的准备及基本要求3.1仪器36〜38C普通温箱，试管架,10ml、5ml、1ml吸管,记号笔，记录纸，显微镜2培养基 （含4%血清及0.1%裂解血球全血）马丁琼脂或酪胨琼脂培养基（G.A）4检验步骤污染杂菌的制品至少重新抽检3瓶，分别进行杂菌计数用普通肉汤或蛋白胨水50倍 稀释，接种于含4%血清及01%裂解血球全血的马丁琼脂平板或酪胨琼脂（G.A）平板上， 每个样品接种2付平板，放置36〜38°C培养48小时，再放置室温24小时，然后分别计算杂 菌菌落（CFU）5安全措施5.1检验过程中注意防止对检验人员和环境的污染5.2检验人员必须穿戴工作服和口罩3滴撒在操作台、地面的异物要进行消毒处理4检验完毕后开封的检品均要经过高压灭菌处理6记录和计算培养72小时后，分别计算每个平板的杂菌数，并把两付平板的杂菌数相加后求平均数， 作为该瓶的杂菌数。
如污染霉菌，亦作为杂菌计算.7结果判定任何1瓶每克组织（或每头剂）的非病原菌数，不应超过所检产品的规定数量5. 支原体检验1技术依据及原理病毒性活疫苗不得含有支原体2注意事项2.1在检测中必须遵守规定的程序，每次都必须设阳性和阴性对照.2.2对每批支原体检验用培养基进行质量检测，并作记录3操作时禁止口吹吸管4操作人员必须戴口罩、工作帽，穿工作服，禁止检验人员将头发留在帽外.2.5保持实验室的清洁卫生，严格遵守常规的消毒制度2.6必须在无菌、无支原体污染的环境条件下操作3材料、仪器、试剂的准备及基本要求3.1仪器36〜38C普通温箱,36〜38C二氧化碳培养箱，显微镜，试管架，10ml、5ml、2ml、1ml 吸管，小试管和100ml培养瓶，记号笔，记录纸 2培养基检测由禽胚组织或其细胞制成的活疫苗用改良Frey氏培养基检测其他种类的活疫苗用支原体培养基4检验步骤4 1样品处理每批制品取样3〜5瓶，混合后备用.如为冻干制品,则加液体培养基复原成混悬液后混 合 2接种与观察液体培养基培养 取5ml疫苗混合物接种于盛20ml小瓶液体培养基中，再从小瓶中分 别取02m1移植接种于2支小管液体培养基内，将小瓶与小管放36〜38°C培养，每日观察 培养物有无颜色变黄或变红。
如在5日尚未见变化，再从小瓶中取02m1移植于另2支管 液体培养基内，继续培养观察5日，如此重复3次若仍无变化，在最后一次接种小管的培 养物经14天观察后停止观察在观察期内，如果发现小瓶或任何一支小管培养物颜色出现 明显变化，pH值变化达土0.5时，应立即移植于小管液体培养基和固体培养基，观察在液体 培养基中是否出现恒定的pH变化，及在固体上有无典型的“煎蛋”状支原体菌落琼脂固体平板培养 在每次液体培养物移植小管培养的同时，取培养物01〜0.2m1接 种琼脂平板2付，放在含5〜10%二氧化碳的潮湿环境下36〜38C培养此外，在液体培养 基颜色出现变化，pH值变化达±0.5时，也同时接种琼脂平板2付各琼脂平板每5〜7天 在低倍显微镜下观察检查有无支原体菌落出现，经14天观察，仍无菌落者停止观察.4.3每次移植培养阳性对照，在同条件下培养观察禽类疫苗用滑液支原体作对照，非禽 类疫苗用猪鼻支原体作对照5安全措施5.1检验过程中注意防止对检验人员和环境的污染检验完毕后开封的产品均要经过高压 灭菌处理 2检验人员必须穿戴工作服和口罩5.3滴撒在操作台、地面的异物和污染的工作服要进行消毒处理.54检验完毕，开封的检品均要经灭菌后再进行处理。
6记录和计算检品在接种相关培养基后，每天培养情况并记录观察结果.7结果判定7.1任何一次琼脂平板上出现支原体菌落，判疫苗或血清不合格2阳性对照中至少有一个平板长菌落，而阴性对照中无菌落生长，则检验有效8附录及附加说明上述小瓶培养基是指100m小瓶中盛培养基20m1；小管培养基是指小试管（1°0X10cm） 中盛入1.0ml培养基小管与小瓶皆须用胶塞或螺旋塑料塞封口外源病毒检验1技术依据及原理由于使用的生物活性原材料、生产过程等均可引起种毒、兽用病毒性活疫苗等污染外源 病毒因此用高效价单特异抗血清中和待检物中相应活性成分或经适当处理后，接种不同的 培养基质,观察病变以检出污染的外源病毒2 注意事项2.1检验所用原材料应符合有关规定 2中和用抗血清应高效价、单特异性2.3严格无菌操作，防止交叉污染3材料、仪器、试剂的准备及基本要求3.1仪器及设备孵化器，CO2培养箱，普通冰箱，普通显微镜，荧光显微镜，水浴锅，照蛋箱.3 2 试剂特异抗血清3.3检验器具小试管、试管架、注射器（1ml），吸管（1ml,5ml，10ml），记号笔3.4样品每批样品3〜5瓶35其它 检验用记录纸、笔等4检验步骤4.1 样品处理4.1.1禽源细胞、种毒及其制品种毒或活疫苗 除另有规定者外，液体样品取2〜3瓶混合，冻干样品取2~3瓶加入稀释 液溶解后混合，用相应单特异抗血清在25r中和1小时以完全中和样品中的活性成分作为 检品。
除另有规定者外，病毒中和剂量为10羽份2非禽源细胞（或细胞系）、种毒及其制品种毒或活疫苗 除另有规定者外，液体样品取2〜3瓶混合，冻干样品取2〜3瓶加入稀 释液溶解后混合，用相应单特异抗血清在25r中和1小时以完全中和样品中的活性成分作为 检品，除另有规定者外，病毒中和剂量为1羽份2检验方法4.2.1禽源细胞、种毒及其制品用鸡胚接种检查法41尿囊腔内接种试验41.1.1试验法 选择发育良好的9〜11日龄SPF鸡胚10枚，每枚尿囊腔内接种0.2ml 检品（如为疫苗,至少含10个羽份），在37r培养7天，弃去在接种后24小时内死亡的鸡胚， 但鸡胚至少成活8/10，试验方可成立.培养结束时打开鸡胚，观察鸡胚有无异常，取尿囊液 做红胞凝集试验，室温静置15~30分钟，观察有无红细胞凝集.41.1.2判定 鸡胚发育正常，尿囊液红细胞凝集阴性，该批制品判合格.42 绒毛尿囊膜（CAM）接种试验4.2.1.21 试验法 选择发育良好的9〜11日龄SPF鸡胚10枚，每枚CAM上接种02ml检品（如为疫苗，至少含10个羽份），在37r培养7天，弃去在接种后24小时内死亡的鸡胚, 但鸡胚至少成活8/10，试验方可成立.培养结束时打开鸡胚，观察鸡胚及CAM有无异常， 取尿囊液做红胞凝集试验，室温静置15〜30分钟，观察有无红细胞凝集。
42判定 鸡胚发育正常，CAM无异常，尿囊液红细胞凝集阴性，该批制品判合格5安全措施检验过程中注意防止人员和环境的污染,检验人员必须穿戴工作服和口罩,严格进行无菌 操作并在相应安全等级（级别）的实验室内进行，以防散毒检验结束后对操作台、地面进 行彻底消毒，用过的吸管浸泡在消毒液中，检验完毕后废弃的产品均经高压灭菌处理7鉴别检验1技术依据及原理将含有对病毒外壳或囊膜抗原的特异抗体的血清与相应疫苗病毒混合，可使两者结合（即中和），使病毒失去对其宿主的感染性用上述中和物接种靶动物（方法1）、鸡胚（方法2）或细胞培养（方法3），观察其是否感染病毒，即可判断疫苗病毒与血清的特异性2试验过程的注意事项21应严格无菌操作除接种动物外，所有操作均应在生物安全试验室或超净工作台中进行 2试验前应知道疫苗病毒的含量或毒价，否则，须先行测定2.3两“中和”物的量要准确，中和温度要恒定，中和期间要适当摇动，并有专人值守.2.4细胞瓶上要有标记，防止错将细胞面放反2.5接种动物要尽量轻柔，保定要得当、确实，以保证检验人员的安全和接种部位及接种 剂量的准确2.6试验完毕要及时清理现场，做好消毒处理工作3试验材料、仪器、试剂的准备及基本要求3.1仪器及设备超净工作台（双人、垂直），恒温水浴锅，计时钟，孵化器，照蛋箱，架盘天平，恒温 培养箱或CO2培养箱，低温冰箱，普通冰箱,倒置显微镜。
3.2 试剂特异性血清，疫苗稀释液（生理盐水、细胞培养液或适于病毒和宿主动物的其他稀释液）， 无机盐类，细胞培养液（MEM、199、乳汉液、乳欧液），健康牛血清，抗生素（青、链霉 素），025%胰酶，细胞分散液EDTA,酚红（1%），消毒剂（酒精、碘酊及脱脂棉球等）.3 3试验器具试管及试管架若干，吸管（1ml、5ml、10ml），注射器（1ml，5ml，10ml）及针头（4#〜6#）， 蛋盘，打孔器，石腊，细胞瓶及瓶塞34 试验动物家兔（1.5〜20kg，用于猪瘟疫苗），鸡胚（SPF胚，9〜11日龄，用于鸡新城疫、支气 管炎疫苗）3.5细胞（根据待检疫苗质量标准选用适宜细胞，按常规方法制备成良好单层）36样品 每批疫苗任取1〜3瓶 7其他检验记录纸、笔等3检验步骤4 1逐瓶核对疫苗及其特异性血清瓶签，分别排放于操作台上4.2稀释疫苗 每批疫苗任取样1瓶（另有规定除外），用该产品质量标准规定的稀释液， 按其含量作10倍系列稀释至质量标准规定的稀释剂量4.3稀释血清对产品质量标准规定需要稀释的特异性血清（马立克氏病特异性血清和传 染性法氏囊病特异性血清），用灭菌生理盐水作倍比稀释至该产品质量标准规定的稀释度。
4.4中和41打开水浴锅电源，设置温度，调整好水温.44.2按其产品质量标准规定的接种量，分别计算疫苗及其特异性血清的中和用量4.4.3根据每批疫苗与血清的中和用量，取适宜灭菌试管1〜3支，分别用记号笔标明“中和”、 “阴性对照”、“阳性对照”等字样，顺序排放于试管架上（产品质量标准中不设“对照”的除外） 4取适宜吸管，定量吸取疫苗稀释液，分别加入到“中和”及“阳性对照”管中 5取适宜吸管，吸取与疫苗稀释液等量的特异性血清，分别加入到“中和”及“阴性对 照”管中.46取适宜吸管，吸取与“疫苗”、“血清”等量的适当稀释液，分别加入到“阳性对照” 和“阴性对照”管中7 按其产品质量标准规定的中和温度及中和时间，核对水浴锅温度无误后,将上述 试管轻轻振摇、混匀后置水浴中和，上好定时钟，由专人值守4.4.8中和时间到，关闭水浴锅电源.取出试管，排放于试管架上4.5 接种45.1接种动物取疫苗中和物及对照物，按其产品质量标准规定的动物品种、等级、数量、年龄、体重、 接种途径、剂量，分别接种动物5.2接种鸡胚取疫苗中和物及对照物，按其产品质量标准规定的鸡胚日龄、数量、接种途径、剂量, 分别接种鸡胚。
45.3接种细胞取疫苗中和物及对照物,按其产品质量标准规定的细胞种类、数量和接种量，分别接种 细胞培养 3.1按常规方法制备细胞单层2选择生长良好的细胞，逐一轻轻幌动细胞面数次后，用酒精棉球擦拭瓶口周围， 再经过酒精灯火焰瞬时烧灼，倒去细胞生长液.4.5.33任取上述细胞1〜2瓶，每瓶按原液量，用吸管换入新的细胞维持液.用记号笔标 记为“细胞对照”4.5.34任取上述细胞3瓶，每瓶用吸管接种相当该细胞瓶生长液量20%的疫苗中和物， 用记号笔标记为“中和后”4.55任取上述细胞3瓶，每瓶用吸管接种相当该细胞瓶生长液量20%的阴性对照物, 用记号笔标记为“一”6任取上述细胞3瓶，每瓶用吸管接种相当该细胞瓶生长液量20%的阳性对照物， 用记号笔标记为"+”7将接种细胞瓶按不同方向轻轻幌动数次，使接种物能均匀散布于整个细胞面上, 然后，置培养箱中吸附一定时间（一般为30~60分钟，期间可再幌动数次）.根据接种物的特 性,也可不经吸附，直接补加细胞维持液；甚或可将接种物加入定量的细胞维持液中,混匀后 直接接种细胞）5.3.8吸附到时，取出细胞培养瓶，按接种顺序，逐瓶补足细胞维持液3.9逐瓶检查瓶口是否塞紧，标记是否正确等。
确认无误后，置培养箱至规定时间4.6蚀斑技术（适用于鸡马立克氏病活疫苗）41按常规方法制备鸡胚成纤维细胞单层4.6.2选择生长良好的细胞至少7瓶，分别倒去细胞生长液3任取上述细胞3瓶，每瓶用吸管接种疫苗中和物0.2ml，用记号笔标记为“中和”4任取上述细胞3瓶，每瓶用吸管接种阳性对照物，用记号笔标记为“阳性对照” 4.6.5将上述接种细胞瓶移至37°C〜38°C培养箱中吸附1小时6取出细胞瓶，每瓶用吸管补加含2%牛血清的199营养液至原液量同时，取正常 细胞1瓶，换以相同营养液置37C〜38C培养24小时7制备营养琼脂（糖）先取2%的琼脂煮沸溶化后，令其降温至46C〜47C，再将 含5%牛血清的199营养液，置水浴中加热至46C〜47C，然后取两者等量混合即成.48取出上述细胞瓶，倒去营养液然后，用吸管吸取相当细胞瓶容量1/10的营养琼 脂（糖），小心复盖在细胞层上，以不产生气泡为宜，立即平放令其凝固 9待琼脂（糖）层凝固后，将细胞瓶倒置于37C〜38C培养箱中，培养5〜7天4安全措施5 1检验人员必须穿戴工作服、鞋、帽和口罩.必要时，还应戴上手套2滴撒在操作台、地面和试管外的检品材料，要及时擦拭消毒。
53用过的吸管、注射器等器具和污染、废弃物要先行消毒处理，再行清洗或丢弃5 记录与计算6.1要严格按照各产品质量标准规定的观察内容和时限，仔细观察，详实记录特别是接种动物、鸡胚的临床反应及组织、病理变化和接种细胞的病变程度或蚀斑数 6.2取出细胞瓶，用肉眼观察瓶底蚀斑接种“疫苗中和物”和“阳性对照物”的细胞应有典型、 清晰、形态不规则、边缘不整齐、直径在0.5〜1.5mm的乳白色蚀斑（而正常细胞则无）计 数时，先用肉眼以蜡笔在瓶底点数，分别求出3瓶细胞的平均蚀斑数，再按下式计算蚀斑减 少率阳性对照平均蚀斑数-样品中和平均数蚀斑减少率= x 100%阳性对照平均蚀斑数 6结果判定按产品质量标准判定71疫苗与特异性血清中和后，接种动物或鸡胚无临床反应和组织病理变化;接种宿主细 胞不产生病变（CPE）；且与“对照”（其产品质量标准规定需设的）差异明显,判该特异性血 清中和试验结果阴性，即该疫苗特异.7.2蚀斑减少率＞95%的鸡马立克氏疫苗判为特异7附录及附加说明8.1如接种动物或鸡胚意外死亡，或接种细胞污染，按其产品质量标准无法判定的，应查明 原因重检8.2当疫苗与特异性血清中和后，接种动物、鸡胚或接种宿主细胞似有一定反应，怀疑此 疫苗未被完全中和所致，可选用更高效价的特异性血清重检。
8灭活疫苗汞类防腐剂含量测定法1技术依据及原理本测定法的原理是样品加硫酸和硝酸，加热进行有机破坏，使硫柳汞的无机汞离子，在 一定条件下与双硫腙生成螯合物,双硫腙的颜色由墨绿色变成黄色，滴定直到双硫腙绿色不 变，汞离子全部螯合为终点，根据样品和对照品的对照滴定可算出样品中的汞离子的量，即 硫柳汞的量2注意事项2.1二氯化汞称重至01354g是困难的，可以取接近数值，近似01354g2.2 1ml注射器标定 用1ml注射器吸取蒸馏水至刻度,然后注入具塞称量瓶中，精密取水至重量，同时测定水的温度，用以下公式计算M1=M/DM1为注射器的实际容量，M为称得水的重量，D为测定温度下水的密度g/ml如：M=09975水温20°C时D=099718则注射器的实际容量为1.0003ml 3油苗的消化是否彻底是试验关键，完全按照操作要求去做2.4凯氏烧瓶和分液漏斗不宜用太大的，否则影响结果和终点观察2.5注射器抽取样品后要直接注入凯氏烧瓶底部，不能碰到瓶颈3材料3 1仪器及设备精密天平，烤箱等3.2试剂二氯化汞(AR)，盐酸羟胺(AR)，硫酸(AR)，硝酸(AR)，双硫腙(AR)，氯仿(AR)， 四氯化碳(AR)3.3试验器具称量瓶、50ml量瓶、5ml、1ml移液管、25ml凯氏烧瓶、分液漏斗(125ml)、1ml注射 器(附15mm针头)4检验步骤4。
1对照品溶液的制备精密称取硫酸干燥器中干燥至恒重的二氯化汞0.1354g，置100 ml量瓶中，加05mol/l 硫酸溶液使溶解到刻度，摇匀精密量取5 ml，置100 ml量瓶中，用05mol/l硫酸溶液稀 释至刻度，摇匀，即得每1 ml溶液含有Hg50以& 42 试液制备(1) 0.05%双硫腙溶液取双硫腙50mg加氯仿100 ml溶解即得棕色瓶中冷暗处保存2) 0.00125%双硫腙溶液取005%双硫腙溶液2. 5ml加四氯化碳稀释至100ml3) 20%盐酸羟胺溶液取盐酸羟胺1g加水至5 ml溶解,即得4) 05 mol/l硫酸溶液取硫酸30ml，缓缓注入适量水中，冷却至室温，加水稀释至刻度，摇匀即得4.3供试品的制备油苗消化 用经标定的1ml注射器（附15 cm长针头）准确量取摇匀的供试品溶液 1ml,置25ml凯氏烧瓶（瓶口附小漏斗）中,加硫酸3ml，加硝酸（1—2）05ml,小心加热, 待爆沸停止后，稍冷，再加硝酸（1—2）05ml—1ml,再加热消化，如此反复加硝酸（1—2）0.5ml， 直至白炽化加热15分钟后，溶液与上次加热的颜色无改变为止，放冷（溶液应无色），加水 20ml，再放冷至室温。
4.4供试品溶液滴定将上述消化液移入125ml分液漏斗，用水多次洗涤凯氏烧瓶使总体积为80ml，加20% 盐酸羟胺溶液5ml，摇匀，用0.00125双硫腙溶液滴定，开始时每次滴加3ml左右,以后逐 渐减少，至每次05ml，最后可少至0.2ml，每次加入滴定液后，强烈振摇10秒钟，静置分层， 弃去四氯化碳层，继续滴定，直至双硫腙的绿色不变，即为终点4.5对照品溶液滴定精密量取对照品溶液1ml （含汞50哽），置125 ml分液漏斗，加水80ml，20%盐酸羟胺 溶液5ml,用000125双硫腙溶液滴定，操作同上供试品溶液滴定毫升数（V1）对照品溶液滴定毫升数（V2）124.6记录与计算汞类含量％（g/ml） = （V1-V2）x（0o 0101-供试品毫升数）-0.6 4.7结果判定将检验结果与产品的质量标准进行对比，按照产品质量标准的规定进行判定附注：试液制备1 0o 05%双硫腙浓溶液 取双硫腙50mg，加氯仿100ml使溶解，即得本品应置棕色瓶 内，再冷暗处保存2 0.00125%双硫腙滴定液 取0.05%双硫腙浓溶液2o 5ml，用四氯化碳稀释至100ml，即 得本液应临用新制3 20%盐酸羟胺试液 取盐酸羟胺1g，加水5ml使溶解，即得。
9.甲醛含量测定法1技术依据及原理本方法与英国药典和欧洲药典的方法原理基本一致.采用甲醛与乙酰丙酮在一定PH条 件下反应，生成物为黄色，利用分光光度法测定反应物在410nm波长处的吸收值，根据样品 和对照品的吸收值算出甲醛的含量.2注意事项本方法测定时如果由于产品中甲醛的含量过高，使吸收值过大时可减少取样量，或扩大 供试品的稀释倍数油苗供试品溶液静置分层时间可适当延长，以增强分层效果，如经过滤 仍不能完全澄清,可继续试验,不影响结果3材料、仪器、试剂的准备及基本要求3.1仪器及设备紫外-可见分光光度计，精密天平和高温箱等.3 2试剂盐酸（AR），甲基红一漠甲酚绿混合指示液，无水碳酸钠（基准），甲醛溶液（AR）,吐温-80 （AR），乙醇（AR），醋酸（AR），醋酸铵（AR），乙酰丙酮（AR），漠麝香草酚蓝指示液， 氢氧化钠滴定液，过氧化氢试液3.3试验器具称量瓶；250ml锥形瓶；50ml量瓶；5ml移液管和5ml吸管；1ml、05ml移液管； 10ml量筒；125ml分液漏斗；水浴锅等4检验步骤4.1盐酸滴定液（1mol/l）的配制与标定4.1.1盐酸滴定液（1mol/l）的配制取盐酸90ml，加水至1000ml，摇匀即得。
42甲基红-漠甲酚绿乙醇混合指示液的配制取01%甲基红乙醇溶液20ml，加02漠甲酚绿乙醇溶液30ml，摇匀即得3盐酸滴定液（1mol/l）的标定取270—300°C干燥至恒重的基准无水碳酸钠1.5g精密称定，加水50ml使溶解，加甲 基红-漠甲酚绿混合指示液10滴，将待标定的盐酸滴定液滴入制备好的碳酸钠溶液中至溶液 由绿色变成紫红色，煮沸2分钟，冷却至室温，继续滴定至溶液由绿色变为暗紫色每1ml 的盐酸滴定液（1mol/l）相当于5300mg的无水碳酸钠根据盐酸滴定液的消耗量与无水碳 酸钠的取用量，算出盐酸滴定液的浓度，用F值表示.记录如下：123基准物+称量瓶重第一次干燥后重（g）基准物+称量瓶重第二次干燥后重（g）倾出基准物后称量瓶重（g）基准无水碳酸钠重（g）盐酸滴定液初读数（ml）盐酸滴定液终读数（ml）盐酸滴定液消耗数（ml）F= W^（VxT）W=称取的基准无水碳酸钠的量（mg） ;V=滴定时消耗的盐酸ml数.T=盐酸滴定液（1mol/l）对基准无水碳酸钠的滴定度mg/ml,即 53.00标定一般要做3 份，相对偏差不应超过0.1%4.2氢氧化钠滴定液（1mol/l）的配制取氢氧化钠106g，加水100ml，振摇使溶解成饱合溶液,冷却后，置聚乙烯塑料瓶中， 静置数日，取澄清的氢氧化钠饱合溶液56ml，加新煮沸过的冷水使成1000ml，摇匀。
4.3甲醛溶液的含量测定取甲醛溶液（GR或AR）1.5ml，精密称定，置锥形瓶中，加水10ml，漠麝香草酚蓝指 示液2滴,滴加氢氧化钠滴定液（1mol/l）至溶液呈蓝色，加过氧化氢试液25ml，再精密加入 氢氧化钠滴定液（1mol/l）25ml，瓶口置一小漏斗,在水浴上加热5分钟，不时振摇，冷却， 用水洗涤漏斗，加漠麝香草酚蓝指示液2滴,用盐酸滴定液（1mol/l）滴定至溶液显黄色，并 将滴定结果用空白试验校正，即得每1ml的氢氧化钠滴定液（1mol/l）相当于3003mg的 CH2O空白试验 取过氧化氢试液25ml和精密量取氢氧。