反转录概念 反转录是以RNA为模板,通过反转录酶,合成DNA的过程，是DNA生物合成的一种特殊方式区分:反转录与逆转录不等同反转录是进行基因工程过程中，人为地提取出所需要的目的基因的信使RNA，并以之为模板人工合成DNA的过程；逆转录是RNA类病毒自主行为，在整合到宿主细胞内以RNA为模板形成DNA的过程二者虽同为RNA→DNA的过程，但地点不同，相对性的来说，反转录在体外，逆转录在体内2 反转录酶与反转录过程 反转录过程由反转录酶催化，该酶也称依赖RNA的DNA聚合酶（RDDP），即以RNA为模板催化DNA链的合成合成的DNA链称为与RNA互补DNA（cDNA）反转录酶存在于一些RNA病毒中，可能与病毒的恶性转化有关人类免疫缺陷病毒（HIV）也是一种RNA病毒，含有反转录酶在小鼠及人的正常细胞和胚胎细胞中也有反转录酶，推测可能与细胞分化和胚胎发育有关 大多数反转录酶都具有多种酶活性，主要包括以下几种活性 ①DNA聚合酶活性；以RNA为模板，催化dNTP聚合成DNA的过程此酶需要RNA为引物，多为色氨酸的tRNA，在引物tRNA3′－末端以5′→3′方向合成DNA。
反转录酶中不具有3′→5′外切酶活性，因此没有校正功能，所以由反转录酶催化合成的DNA出错率比较高 ②RNase H活性；由反转录酶催化合成的cDNA与模板RNA形成的杂交分子，将由RNase H从RNA5′端水解掉RNA分子 ③DNA指导的DNA聚合酶活性；以反转录合成的第一条DNA单链为模板，以dNTP为底物，再合成第二条DNA分子 除此之外，有些反转录酶还有DNA内切酶活性，这可能与病毒基因整合到宿主细胞染色体DNA中有关反转录酶的发现对于遗传工程技术起了很大的推动作用，目前它已成为一种重要的工具酶用组织细胞提取mRNA并以它为模板，在反转录酶的作用下，合成出互补的DNA(cDNA)，由此可构建出cDNA文库(cDNA library)，从中筛选特异的目的基因，这是在基因工程技术中最常用的获得目的基因的方法 反转录的简要过程表示如下： 反转录酶的作用是以dNTP为底物，以RNA为模板，tRNA(主要是色氨酸tRNA)为引物，在tRNA3′桹H末端上，按5′→3′方向，合成一条与RNA模板互补的DNA单链，这条DNA单链叫做互补DNA(complementary DNA, cDNA)，它与RNA模板形成RNADNA杂交体。
随后又在反转录酶的作用下，水解掉RNA链，再以cDNA为模板合成第二条DNA链至此，完成由RNA指导的DNA合成过程3 生物学意义 反转录的发现有重要的理论意义和实践意义 （1）对分子生物学的中心法则进行了修正和补充，修正后的中心法则表示为：是指遗传信息从DNA传递给RNA，再从RNA传递给蛋白质，即完成遗传信息的转录和翻译的过程也可以从DNA传递给DNA，即完成DNA的复制过程这是所有有细胞结构的生物所遵循的法则某些病毒中的RNA自我复制（如烟草花叶病毒等）和在某些病毒中能以RNA为模板逆转录成DNA的过程（某些致癌病毒）有些病毒（如阮病毒，即疯牛病病毒）以蛋白质直接形成蛋白质 （2）在致癌病毒的研究中发现了癌基因，在人类一些癌细胞如膀胱癌、小细胞肺癌等细胞中，也分离出与病毒癌基因相同的碱基序列，称为细胞癌基因或原癌基因癌基因的发现为肿瘤发病机理的研究提供了很有前途的线索3）在实际工作中有助于基因工程的实施由于目的基因的转录产物易于制备，可将mRNA反向转录形成DNA用以获得目的基因RNA反转为cDNA10μl体系mix2μlRNA500ngAdd to 10μlPCR 程序37 ℃10min85℃5s稀释产物即可用于后续实验。
实验三 PCR扩增制备目的基因1．目的学会PCR操作的基本技术2．原理 是将待扩增的DNA模板加热变性，与其两侧互补的寡聚核苷酸引物复性，然后经过耐热的DNA聚合酶延伸再进入下一轮变性—复性—延伸的循环，n次循环后DNA可被扩增（1+X）n倍其中<25nt的引物退火温度Tm=2（A+T）+4（G+C）3．器材旋涡混合器，微量移液取样器，移液器吸头，0.2ml PCR微量管，双面微量离心管架，PCR仪，台式离心机，琼脂糖凝胶电泳系统，水漂，恒温水浴4．试剂 3U/μl Taq DNA聚合酶，PCR缓冲液（10×，MgCl2 free），25mM MgCl2，dNTP，引物，模板质粒pMD18-T-NK，无菌dd water 5．实验准备dNTP混合液（每种25mM），TAE电泳缓冲液，1000´溴化乙锭储存液（0.5mg/ml），10´加样缓冲液，1.5ml离心管装入铝制饭盒（灭菌）、移液器吸头装入相应的吸头盒（灭菌）合成的引物：Sense primer Antisense primer 目的基因模板质粒 待扩增的NK片段长度 6．操作步骤（1） 在0.2ml PCR 微量离心管中配制20μL反应体系。
以下加样量供参考，括号内是最终需要量，实验时需参照Taq酶说明书计算） dd water 13.9μL 10×PCR buffer（含MgCl2） 2μL 2.5mmol/L dNTP 2μL Primer1 0.5μL primer2 0.5μL 模板质粒 1μL 3U/μl Taq酶 0.1μL（3u） 总体积 20μL（2）根据厂商的操作手册设置PCR仪的循环程序： ① 94℃ 3min ② 94℃ 30sec ③ 55℃ 30sec ④ 72℃ 1min ⑤ goto② 35 times ⑥ 72℃ 10min（3）PCR结束后，取10μL产物进行琼脂糖凝胶电泳观察胶上是否有预计的主要产物带4）清理桌面，撰写实验报告。
5）PCR产物可以直接与T载体连接，然后转化感受态细胞7．思考 （1）复性温度如何确定？ （2）为什么要在最后延伸10min？ （3）是否有非特异性扩增产物（或引物二聚体），如何才能消除？ 。