基于溶胶胶－凝胶胶固定技技术的生生物组织织传感器器宣俊 陈陈利兴 许长流流（中山大大学化学学与化学学工程学学院20000级级，广州州5100275500）指导老师师：蔡沛沛祥教授授摘要：报报道一个个关于制制备生物物组织传传感器的的新技术术，将溶溶胶－凝凝胶与植植物液汁汁按一定定比例结结合，使使天然植植物中的的多酚氧氧化酶被被固定于于溶胶－－凝胶中中，将其其滴涂于于预先涂涂有一层层Naffionn膜的铂铂盘电极极表面，构构成带有有Naffionn－溶胶胶凝胶－－植物液液汁的复复合修饰饰膜的生生物传感感器，用用于测定定神经递递质多巴巴胺采采用循环环伏安法法和线性性扫描伏伏安法考考察了传传感器的的电化学学特性,,比较了了不同植植物品种种、不同同组织位位置的生生物催化化活性，研研究了乙乙醇用量量、水酯酯比、植植物液汁汁用量等等因素的的影响，考考察了NNafiion膜膜的防干干扰功能能采用用差示脉脉冲伏安安法对多多巴胺进进行定量量分析，线线性范围围为2ⅹⅹ10-66～1ⅹ10-44moll/L,,检出限限为8..0ⅹ10-7moll/L与与传统的的组织电电极相比比，本传传感器具具有一系系列特点点。
关键词：：溶胶-凝凝胶，固定化化技术，植植物组织织传感器器，多巴巴胺1、前言言多巴胺（DDA）是是人体一一种重要要的神经经递质，其其浓度的的大小可可直接引引发起人人体的一一些精神神性疾病病如：：抑郁症症、老年年痴呆、帕帕金森等等因此此，为了了更准确确灵敏地地检测多多巴胺浓浓度的大大小，人人们从多多方面对对其进行行研究生物传感感器是化化学传感感器的一一个分支支生物物传感器器成功的的关键是是生物材材料固定定技术组组织电极极（包括括植物组组织电极极、动物物组织电电极）是是生物传传感器的的一种植植物组织织电极问问世于八八十年代代初，是是利用天天然植物物中存在在的酶直直接作为为生物催催化剂的的一种生生物传感感器从文献可可以看到到，以往往人们对对植物组组织电极极的研究究，从电电极结构构来看，主主要有切切片组织织电极和和碳糊电电极两种种类型切片的组组织电极极采用夹夹心面包包式的物物理固定定法将植植物组织织切片固固定，需需要特定定的基础础电极（如如O2电极、NNH3电极等等）作为为转换器器，组装装时还需要在在组织片片与基础础电极之之间设置置透气膜膜，在组组织片外外加上保保护网等等，电极极的制作作比较繁繁琐。
碳糊电极极的制作作比较简简单只只要将植植物组织织磨成浆浆，按一一定的比比例与石石墨粉混混合调成成碳糊，填填入电极极杆下端端，磨平平后即可可使用虽虽然碳糊糊电极制制作简单单，但是是生物活活性物质质易从电电极表面面流失，而而且碳糊糊在溶液液中浸泡泡时容易易松散脱脱落，更更经不起起搅拌时时溶液的的冲擦基于以上上两种电电极的存存在问题题，我们们提出了了关于植植物组织织电极固固定生物物材料的的新技术术——溶胶胶凝胶技技术溶胶凝胶胶玻璃是是由烷氧氧基硅烷烷(如SSi(OOCH33)4)或类类似的有有机金属属烷氧化化物(如如异丙氧氧基钛或或异丙氧氧基铝))在常温温下水解解和缩聚聚而成的的透明的的玻璃状状物质网网络结构构的硅烷烷聚合物物能包埋埋各种生生物活性性物质，并并能让它它们在孔孔隙中自自由地移移动或与与孔隙内内表面的的硅醇基基团进行行某种程程度上的的相互作作用溶溶胶凝胶胶材料具具有物理理刚性、化化学惰性性、高热热稳定性性和轻微微溶胀性性，它的的低温聚聚合过程程的特点点更是有有利于生生物材料料的固定定实验中，我我们对不不同植物物组织汁汁进行了了比较实实验结结果发现现在各种种植物组组织中，以以苹果内内部组织织最好，且用同同一根生生物电极极可多次次重复检检测不同同浓度的的待测样样品，具具有较好好的实验验研究价价值。
2、研究究内容2.1 仪器和和试剂CHI 7500A型电电化学工工作站（上上海辰华华仪器公公司），超声波波清洗器器（明珠珠电器有有限公司司），三电极系系统：所所研制的的多巴胺胺传感器器为工作作电极，饱饱和甘汞汞电极为为参比电电极，铂铂丝电极极为对电电极正正硅酸乙乙酯（TTEOSS，Alldriich公公司），Triitonn X--1000（Reeseaarchh公司），Nafion-117（5%的乙醇溶液，Fluka公司），盐酸多巴胺（DA，Sigma公司），盐酸多巴胺注射液（江苏林海药业有限公司制造分公司），盐酸肾上腺素注射液（EP，广州明兴制药厂），抗坏血酸（维生素C药片，AA，广东华南制药厂）以0.11moll/L Na22HPOO4-0..1mool/LL KHH2PO4缓冲溶溶液（PPBS，ppH=77.4）为为测试底底液试剂均为为分析纯纯，实验验用水为为二次蒸蒸馏水2.2 二氧化化硅溶胶胶凝胶的的制备将60μμLTEEOS、4410μμL水、112μL0.11moll/L HCLL和2滴滴 Trritoon XX-1000混合合，室温温下超声声振荡11h，使使其形成成均匀澄澄清的溶溶胶，然然后在电电冰箱中中放置22～3hh。
使用用前用00.011moll/L NaOOH中和和约等于于pH==7.442.3 多巴胺胺传感器器的制备备将铂盘电电极（фф1mmm）在金金相砂纸纸上打磨磨抛光，依依次在HHNO33（1::1）、丙丙酮和双双蒸水中中超声清清洗155minn，清洗洗后的电电极置于于室温下下晾干备备用用微量注注射器将将5μL含体体积分数数为5%% Naafioon的乙乙醇溶液液滴涂于于电极表表面，室室温下晾晾干备用用将1000μL苹果汁汁加到已已制好的的二氧化化硅溶胶胶中，充充分振荡荡均匀用用微量注注射器吸吸取5μμL苹果果汁溶胶胶-凝胶胶，滴涂涂于已经经用Naffionn修饰的的干燥的的铂盘电电极表面面，室温温下晾干干待测2.4 实验方方法电化学测测量采用用三电极极系统，以以所研制制的植物物电极为为工作电电极，饱饱和甘汞汞电极为为参比电电极，铂铂丝电极极为对电电极00.1mmol//L NNa2HPOO4-0..1mool/LL KHH2PO4缓冲溶溶液（PPBS，ppH=77.4）为为测试底底液采采用循环环伏安法法（CVV）研究究传感器器的电化化学特性性，采用用示差脉脉冲伏安安法（DPVV）对DDA进行行定量分分析。
除除另有说说明外，实验所所用的多多巴胺溶溶液的浓浓度为CCDA=11.055×10-33moll/L2.5 实验原理理许多植物物组织中中都含有有多酚氧氧化酶，它它能催化化多巴胺胺，在电电极上氧氧化成醌醌式产物物而氧化产产物又能能在电极极上还原原，当对对电极进进行电位位循环扫扫描时可可以获得得多巴胺胺的氧化化和还原原电流峰峰实验验表明用用苹果汁汁-溶胶胶-凝胶胶修饰电电极对多多巴胺溶溶液进行行循环伏伏安法电电位扫描描时，得得到氧化化还原电电流峰（图图1，aa,b），而不不含植物物组织的的溶胶凝凝胶电极极和裸电电极所产产生的CCV曲线线显得平平缓(图图1，cc,d))又用用苹果汁汁-溶胶胶-凝胶胶修饰电电极对PPBS底底液进行行循环伏伏安法电电位扫描描，得到到的CVV曲线显显得平缓缓（图11，e）从修饰电极对多巴胺溶液的循环伏安响应曲线可以看到，它的阳极峰电位是0.337V，阴极峰电位是0.154V证明苹果汁中的酶对多巴胺的电极过程起了催化氧化的作用图1 多巴胺胺伏安图图a Naafioon-苹苹果汁--溶胶--凝胶修修饰电极极对DAA的响应应b苹果汁汁-溶胶胶-凝胶胶修饰电电极对DDA的响响应c不含植植物组织织的溶胶胶-凝胶胶电极对对DA的的响应d裸电极极对DAA的响应应e Naafioon-苹苹果汁--溶胶--凝胶修修饰电极极在PBBS底液液中3、实验验条件优优化、选选择及讨讨论3.1植植物组织织的选择择(一) 植物种类类的选择择分别提取取苹果、番番茄、土土豆、白白菜、紫紫荆花、龙龙船花和和琵琶果果的液汁汁加入溶溶胶凝胶胶里面制制成传感感器，以以循环伏伏安法观观察响应应电流，发发现由以上各各种植物物制得的的传感器器都有响响应电流流，说明明各种植植物都含含有能对对多巴胺胺起催化化作用的的氧化酶酶。
测量量数据如如表1：表1 不同植物品种的催化效果比较植物种类 ipc/A番茄 2.588E-07紫荆花 3.475E-07白菜 3.926E-07琵琶果 4.218E-07土豆 6.358E-07龙船花 1.147E-06苹果 1.385E-06从响应电电流峰的的高低来来看，苹苹果和龙龙船花的的提取液液较适合合作为研研究对象象，其他他植物的的提取液液响应不不够灵敏敏，而且且有些植植物（如如土豆）提取不够方便，液汁中淀粉质过多，不利于溶胶凝胶对液汁中酶的包埋，影响修饰电极的使用而龙船花提取液虽然响应较好，但收集原料较困难，因此决定以苹果作为研究对象二) 苹果种种类部位位的选择择取两种不不同种类类的苹果果：香蕉蕉苹果和和红富士士苹果，分分别取其其外、中中、内层层果肉做做对比实实验（表表2）表2 苹果中不同部位催化效果比较苹果的不同部位 ipc/A香蕉苹果外层 5.194E-07香蕉苹果中层 8.915E-07香蕉苹果内层 1.096E-06富士苹果外层 7.953E-07富士苹果中层 8.917E-07富士苹果内层 2.383E-06红富士苹苹果提取取液制得得的修饰饰电极的的响应峰峰电流普普遍比香香蕉苹果果的高；；而外、中中、内层层果肉提提取液的的修饰电电极的响响应依次次增大，决决定以红红富士苹苹果的内内层果肉肉作为植植物组织织液汁的的来源。
3.2 溶胶胶－凝胶胶配比的的选择(一)乙乙醇加入入量的选选择在配制溶溶胶凝胶胶时加入入乙醇量量的多少少与响应应电流峰峰高低有有关，通通过对比比实验，得得到表3数据表3 乙醇加加入量对对传感器器性能的的影响乙醇加入入量/μLipc/A02.4412EE-077201..4022E-007401..4744E-007乙醇量加加得少，响响应峰电电流比较较高，不不加乙醇醇时的响响应峰电电流最高高因此此决定在在配制溶溶胶凝胶胶时不加加乙醇原因是乙醇会损害酶的活性二） 水酯比RR的确定定水酯比RR指凝胶胶中水和和硅酯类类量的比比值据据文献报报道，水水与硅酯酯的比值值大于44时，能能加速硅硅酯键的的水解，易易形成分分子量大大的网状状聚合物物，聚合合物的空空隙度和和比表面面积较大大这类类聚合物物对生物物活性物物质的包包埋与固固定有利利当比比值小于于4时，硅硅酯键水水解不充充分，易易形成分分子量小小、链状状的聚合合物此此时聚合合物的网网孔较小小，不利利于酶或或蛋白质质的固定定当水水酯比RR在6～～10的的范围内内，R值值越大，酶酶的固定定越好分分别配置置水酯比比R为55～100的溶胶胶凝胶，制制成传感感器作平平行测量量对比如如表4。
表4 水酯比对传感器性能的影响R ipc/A4 7.637E-075 8.811E-076 1.042E-067 1.291E-068 1.184E-069 1.357E-0610 9.634E-07可见当RR＝9时时峰电流流最大，决决定采用用这个比比例三）、溶胶凝凝胶中植植物液汁汁包埋量量的选择择向溶胶凝凝胶中加加入苹果果汁量的的多少也也会影响响测定多多巴胺的的效果，苹苹果汁加加入量的的对比实实验结果果如表5表5 苹果汁用量对传感器性能的影响苹果汁加入量（占溶胶的比例） ipc/A二分之一 5.580E-07三分之一 7.329E-07四分之一 8.578E-07五分之一 1.039E-06六分之一 1.779E-06八分之一 1.234E-06十分之一 9.668E-07在一定比比例范围围内，相相应修饰饰电极的的峰电流流随苹果果汁加入入量的增增多而增增大，但但苹果汁汁加得过过多的时时候相应应的峰电电流反而而下降。
根根据峰电电流的高高低决定定苹果汁汁的加入入量（VV/V）为1/66（即若若最后配配得的溶溶胶凝胶胶体积为6600单单位，则则所含苹苹果汁的的量为1100单单位）3.3 电位扫扫描条件件的确定定(一) 扫描速速度的选选择讨论修饰饰电极工工作时多多巴胺在在电极上上的富集集过程是是靠扩散散控制还还是受吸吸附控制制（因为为若制备备电极时时所用苹苹果汁含含淀粉质质比较多多时会出现现吸附富富集的现现象）两种情情况下扫扫描速度度对峰电电流的影影响有所所不同在不同的的扫描速速度下测测得的实实验结果果见表66表6扫描描速度的的影响 v/VV s--1v1/22峰电流//A0.05500.22236111.222E-0060.07750.27738661.322E-0060.10000.31162331.455E-0060.12250.35535551.655E-0060.15500.38873001.855E-0060.17750.41183332.100E-0060.20000.44472112.333E-006可见峰电电流与扫扫描速度度的平方方根的关系系并不是是正比关关系，也也就是说说，多巴巴胺在电电极上的的富集是是由吸附附控制的的。
本实实验所选选择的实验扫扫描速度度为1000mVV/s二) 停留时时间的影影响在进行阴阴极扫描描之前，于于0.66V下，停停留时间间对响应应峰电流流的峰高高有影响响设定定不同停停留时间间（2ss,5ss,100s,115s,,20ss,255s）,,分别测测定同一一多巴胺胺样品得得表7数据表7 静静止时间间对传感感器性能能影响静止时间间/sipc//A26.0559E--0756.4669E--07107.2114E--07157.5007E--07207.5551E--07257.0004E--07停留时间间对响应应电流的的影响也也进一步步证实了了电极过过程具有有吸附特特性当当停留220s时时，多巴巴胺的响响应峰电电流响应应较高，决决定停留留时间定定为200s三）、电位扫扫描范围围的选择择确定起始始电位为为-0..2v，在在不同的的上限电电位下扫扫描峰电电位也有有较大影影响如如表8，分别别采用不不同的上上限电位位测量同同一样品品得到的的结果 表8 上限电电位对传传感器性性能影响响上限电位位/vipc//A0.42.9115E--070.66.5331E--070.89.1884E--071.01.5886E--061.22.2663E--06可见峰电电流随上上限电位位增加而而趋于增增大，考考虑到窄窄电位扫扫描可排排除某些些物质的的干扰，最最后将扫扫描电位位定在--0.22v～-0..6v。
4、多巴巴胺传感感器的选选择性4.1抗抗坏血酸酸(AAA)干扰扰消除 AA的的消除：：由于抗抗坏血酸酸(AAA) 的的氧化电电位与DDA接近近，严重重干扰测测量对对此，我我们在植植物溶胶胶凝胶电电极上修修饰一层层Naffionn膜因因为在生生理pHH条件下下，(本本实验用用PBSS缓冲液液) ，DDA为阳阳离子，而而AA为为阴离子子，利用用Naffionn膜磺酸酸根阴离离子与AAA阴离离子的排排斥作用用，可以以较好地地消除AAA对DDA的测测量，如如图3图3修饰电极对AA的响应a-苹果汁-溶胶-凝胶电极对AA的响应b-Nafion-苹果汁-溶胶-凝胶电极对AA的响应如图4:: 曲线线a为普通通植物电电极对DDA的响响应曲线线，曲线b为为没加NNafiion膜膜电极所所测得DDA与AAA混合合溶液的的响应曲曲线，可可见AAA对DAA起了很很大的干干扰对对此，利利用Naafioon膜后后，在DDA与AAA混合合溶液中中测量得得曲线cc，结果果表明，加加了Naafioon膜后后可较好好地消除除AA对对DA干干扰图4 修饰电极在DA、DA与AA混合溶液的响应a-苹果汁-溶胶-凝胶电极对DA的响应 b-苹果汁-溶胶-凝胶电极在DA和AA混合溶液中的响应c-Nafion-苹果汁-溶胶-凝胶电极在DA和AA混合溶液中4.2肾肾上腺素素干扰消消除由于肾上上腺素（EEP）和和DA都都是常存存在于生生物体内内的神经经递质，对对此我们们向DA溶溶液加进进一定量量的肾上上腺素，考察其对对DA有有没有干干扰（图5）。
结结果表明明添加了了Naffionn膜的组组织电极极能排除除EP对对DA的的干扰 图5 Nafion膜对EP干扰的排除a-苹果汁-溶胶-凝胶修饰电极在EP中b-Nafion-苹果汁-溶胶-凝胶修饰电极在EP中c-Nafion-苹果汁-溶胶-凝胶修饰电极在DA和EP混标中5、分析析应用配制一系系列浓度度的多巴巴胺标准准溶液，采采用示差差脉冲伏伏安法及及利用NNafiion--苹果汁汁－溶胶胶－凝胶胶修饰电电极对多多巴胺标标准溶液液进行测测定，绘绘制工作作曲线（图图6）结果表明，多巴胺浓度在2×10-6 mol/L～1×10-4 mol/L范围内响应电流呈良好的线性关系吸取多巴巴胺针剂剂溶液330µL，用用PBSS定容配配成255mL（即即多巴胺胺浓度为为6.333×10-55moll/L）用用本传感感器进行行定量分分析，测测得多巴巴胺的浓浓度为66.588×10-55moll/L，实实验误差差为3.99%参考文献献[1] 蔡沛沛祥，黄昊，余新志志，聂兵，“对多巴巴胺敏感感的植物物组织碳碳糊生物物电极的的改进”，传感技技术学报报，19996,33, ((1)：：75--78[2] 唐尹尹平，成凤桂桂，“Soll-Geel固定定法制作作生物传传感器应应用及发发展”，中南民民族学院院学报，20000，33，199(1)):89--93[3] 何星星存，李平，莫金垣垣，“用修饰饰电极导导数伏安安法同时时测定多多巴胺和和肾上腺腺素”，分析测测试学报报，20000，11，199(1)):19--21[4] 汪振辉辉，郏建波波，李工安安，周漱萍萍，“多巴胺胺在聚茶茶碱Naafioon双层层修饰玻玻碳电极极上的电电化学行行为”，分析化化学，220000,5,,28((5)::5688-5772[5] 邓家家祺，方方跃，“植物组组织电极极”，化学学传感器器，19990，10(3)：5-10[6] 沈国国励，陈陈光焰，水水冰，“土豆组组织膜儿儿茶酚电电极的研研究”，分析析化学，119900，188(4)：3115-3199A Tiissuue BBiossenssor Bassed On Soll-geel IImmoobillizaatioon TTechhniueXuann Juun, Chhen Lixxingg, Xuu Chhanggliuu(Claass 20000, Schhooll off Chhemiistrry aand Cheemiccal Enggineeeriing,, SuunYaat-ssenUUnivverssityy, Guuanggzhoou 55102275))Adviisorr: CCai PPeixxianng, ProofesssorrAbsttracct：In thiis ppapeer,a nnew tecchniiquee onn prrepaarattionn off biioseensoor iis rrepoorteed.SSiO22 sool-ggel andd pllantt juuicee arre mmixeed aa ceertaain prooporrtioon tto mmakee thhe eenzyyme froom nnatuure plaant immmobiilizzed in thee SiiO2 sool-ggel fillm.TThe doppamiine bioosennsorr iss prrepaaredd frrom a pplattinuum eelecctroode coaatedd wiith a NNafiion fillm aand theen tthe middifiied SiOO2 sool-ggel layyer..Cycclicc vooltaammeetryy(CVV) aand Linnearr sccan volltammmettry aree ussed to invvesttigaate thee ellecttrocchemmicaal ccharractteriistiics of thee seensoor.TThe cattalyysiss efffecct oof ddifffereent plaant speeciees aand parrts is commparred..Thee doosagge oof eethaanoll,waaterr,TEEOS andd pllantt juuicee iss sttudiied..Thee liineaaritty oof DDA iin tthe rannge of 2ⅹ10-66～1ⅹ10-44moll/L witth ddeteectiion limmit of 8.00ⅹ10-77moll/L andd thhe ccorrrelaatioon ccoeffficciennt oof 00.9999 aare obttainned by diffferrenttiall puulsee vooltaammeetryy(DPPV)..No intterffereencee waas ffounnd ffromm asscorrbicc accid,,nittritte,uuricc accid,,epiinepphriine andd nooraddrennaliin iin tthe dettermminaatioon oof DDA.SSatiisfaactoory dettermminaatioon rresuultss off DAA inn saamplles aree obbtaiin bby tthiss meethood.Keywwordds:SSiO22 sool-ggel,,Tecchniiquee off immmobbiliizattionn,Pllantt tiissuue ssenssor,,Doppamiine..。