第六章第六章联用技术联用技术(Hyphenated Techniques)6.1导言导言6.2新质谱法新质谱法6.3色谱质谱联用色谱质谱联用6.4电化学光谱联用电化学光谱联用6.5毛细管电泳光谱联用毛细管电泳光谱联用参考书：参考书：生物质谱技术与方法生物质谱技术与方法，杨，杨芃芃原，钱小红，原，钱小红，盛龙生盛龙生 编著，科学出版社，编著，科学出版社，2003生命分析化学生命分析化学，汪尔康，陈义，科学出版社，汪尔康，陈义，科学出版社，200620066.1导言导言随着生命科学、材料科学和环境科学等的发展和需求，复杂样随着生命科学、材料科学和环境科学等的发展和需求，复杂样品体系的分离、分析已成为分析化学的重要研究方向和研究热品体系的分离、分析已成为分析化学的重要研究方向和研究热点之一所谓复杂样品体系，不仅仅是指样品中的组分多样性，而且还包所谓复杂样品体系，不仅仅是指样品中的组分多样性，而且还包含完全不同体系的物质共存于一个样品中含完全不同体系的物质共存于一个样品中例如：无机与有机化例如：无机与有机化合物共存一体，高分子、大分子与小分子化合物共存一体，生命合物共存一体，高分子、大分子与小分子化合物共存一体，生命与非生命物质共存一体等。
如果要对复杂样品体系提供全面、准与非生命物质共存一体等如果要对复杂样品体系提供全面、准确的结构与成分表征信息，那么其分析过程可能包括从常量到微确的结构与成分表征信息，那么其分析过程可能包括从常量到微量、痕量分析，从成分到结构、形态分析，从总体到微区、表面、量、痕量分析，从成分到结构、形态分析，从总体到微区、表面、空间分布分析，从宏观形貌到微观结构分析，从静态到动态、时空间分布分析，从宏观形貌到微观结构分析，从静态到动态、时间分辨分析，从破坏到非破坏分析等等因此，为了圆满完成复间分辨分析，从破坏到非破坏分析等等因此，为了圆满完成复杂样品体系的全分析，需要综合利用包括色谱法和质谱法在内的杂样品体系的全分析，需要综合利用包括色谱法和质谱法在内的多种现代分离、分析方法多种现代分离、分析方法联用技术的重要性和必要性！联用技术的重要性和必要性！本章在简介新质谱方法的同时，也将介绍色本章在简介新质谱方法的同时，也将介绍色谱谱-质谱质谱联用技术联用技术及及接口技术接口技术的发展，还将介的发展，还将介绍各种不同模式和类型的色谱绍各种不同模式和类型的色谱-质谱联用技术质谱联用技术的实现、研究进展及其在生命科学研究领域的实现、研究进展及其在生命科学研究领域中的应用，以及其它联用技术，如电化学中的应用，以及其它联用技术，如电化学光谱，毛细管电泳光谱联用等。
光谱，毛细管电泳光谱联用等6.2 新质谱法新质谱法6.2.1 质谱学简介及其特点质谱学简介及其特点1906年年J.J.Thomson发明了质谱仪发明了质谱仪(Mass spectroscopy,MS)，但直至但直至1920s左右质谱法才逐渐成为一种分析手段，被化学左右质谱法才逐渐成为一种分析手段，被化学家采用从家采用从1940s以后以后MS广泛地应用于有机物质分析广泛地应用于有机物质分析1980s末期新软电离技术的发明，能够用于分析高极性、难末期新软电离技术的发明，能够用于分析高极性、难挥发和热不稳定样品之后，生物质谱才发展起来挥发和热不稳定样品之后，生物质谱才发展起来常规质谱分析仪的质量范围是几十到常规质谱分析仪的质量范围是几十到2000 da生物质谱生物质谱(新质谱法新质谱法)是现代分析化学及相关生化研究的热点是现代分析化学及相关生化研究的热点之一和蛋白质组学的主要手段之一和蛋白质组学的主要手段质谱法的特点：质谱法的特点：(1)高灵敏度，可测高灵敏度，可测10-8mol以下物质的量；以下物质的量；(2)快速，数分钟内即可完成测试；快速，数分钟内即可完成测试；(3)能同时提供样品的精确分子质量和结构信息；能同时提供样品的精确分子质量和结构信息；(4)既可用于定性分析，也可用于定量分析；既可用于定性分析，也可用于定量分析；(5)能有效地与各种色谱技术联用，如能有效地与各种色谱技术联用，如GC/MS，HPLC/MS，TLC/MS及及CZE/MS等，用于复杂等，用于复杂 体系分析。
体系分析MS的特点可概括为的特点可概括为4个个S:灵敏灵敏(sensitivity)、快速、快速(speed)、专一、专一(specificity)、化学计量、化学计量(stoichiometry)在过去的几十年中，生物质谱的主要进展在于解决如在过去的几十年中，生物质谱的主要进展在于解决如何测定大质量分子质荷比何测定大质量分子质荷比m/z及其相关的问题，主要的及其相关的问题，主要的研究领域包括：研究领域包括：(1)如何扩大质谱仪器的质量范围？如何扩大质谱仪器的质量范围？(2)如何使生物大分子电离和使其带多电荷如何使生物大分子电离和使其带多电荷(即降低即降低m/z)？(3)如何解释大质量分子质谱？如何解释大质量分子质谱？(4)如何发展生物大分子质谱测定方法？如何发展生物大分子质谱测定方法？Fred M.McLafferty et al,Science,2006,314,109-112报道了采用报道了采用MS可研究质量大于可研究质量大于200 Kda的蛋白质！的蛋白质！与质谱相关而获得诺贝尔奖的有：与质谱相关而获得诺贝尔奖的有：J.J.Thomson(物理物理1906，发明质谱技术并用于研究，发明质谱技术并用于研究气体的电导气体的电导)；F.W.Aston(化学化学1922，用质谱仪发现了非放射性元，用质谱仪发现了非放射性元素的同位素素的同位素)；W.Paul(物理物理1980，发明离子阱质谱原理与技术，发明离子阱质谱原理与技术)；R.F.Curl、R.E.Smalley和和H.W.Kroto(化学化学1996，用，用质谱仪观察到激光轰击下产生的质谱仪观察到激光轰击下产生的C60)；K.Tanaka(田中耕一田中耕一)和和J.B.Fenn(化学化学2002，发明，发明MALDI-MS和和ESI-MS技术技术)。
生物质谱的最基本用途是能够测量多肽生物质谱的最基本用途是能够测量多肽/蛋白质蛋白质/核酸等生物大分核酸等生物大分子的分子质量，并间接推测它的结构及相互作用子的分子质量，并间接推测它的结构及相互作用1994年蛋白质组学第一次被提出年蛋白质组学第一次被提出(Marc Wilkins)，随后生物质谱，随后生物质谱被确认为蛋白质组学技术平台的重要组成部分，认识到生物质谱被确认为蛋白质组学技术平台的重要组成部分，认识到生物质谱另一吸引人之处是可以取代另一吸引人之处是可以取代Edman降解测序方法，了解蛋白生成降解测序方法，了解蛋白生成的早期结构域，以及可以鉴定翻译后修饰的能力另外，生物质的早期结构域，以及可以鉴定翻译后修饰的能力另外，生物质谱还可以用来测定非共价键作用如抗体谱还可以用来测定非共价键作用如抗体-抗原结合作用抗原结合作用2001以后，随着基因组测序计划的完成，蛋白质组学的规模化以后，随着基因组测序计划的完成，蛋白质组学的规模化已成定局，生物质谱正在发挥着不可取代的中坚作用已成定局，生物质谱正在发挥着不可取代的中坚作用蛋白质组学的研究之所以能够蓬勃发展，主要依赖于高通量分离蛋白质组学的研究之所以能够蓬勃发展，主要依赖于高通量分离和分析技术的突破性进展。
首先是质谱技术，尤其是软电离技术和分析技术的突破性进展首先是质谱技术，尤其是软电离技术的发展和双向的发展和双向(二维二维)凝胶电泳技术的完善，使得蛋白质的大范围凝胶电泳技术的完善，使得蛋白质的大范围高通量分析成为可能高通量分析成为可能蛋白质组学蛋白质组学(Proteomics)生物质谱！生物质谱！Proteomics is the study of the proteome,the protein complement of the genome.The terms”proteomics”and“proteome”were coined by Marc Wilkins and colleagues in the early 1990s and mirror the terms“genomics”and“genome”,which describe the entire collection of genes in an organism.Introduction to Proteomics,Daniel Liebler.2002,Humana Press蛋白质组学目前面临的最大挑战是什么？蛋白质组学目前面临的最大挑战是什么？6.2.2 各种质谱技术各种质谱技术质谱仪的一般结构框图如图质谱仪的一般结构框图如图6.1所示。
质谱分析是一个制备样品所示质谱分析是一个制备样品或从其他分析仪器引入样品或从其他分析仪器引入样品样品气化并离子化样品气化并离子化引入样品离引入样品离子到分析器子到分析器在分析器中按照离子的质荷比不同分离离子在分析器中按照离子的质荷比不同分离离子分分别检测各种离子并得到质谱图的过程别检测各种离子并得到质谱图的过程图图6.1 质谱仪器组成示意图质谱仪器组成示意图质谱仪的核心是质谱仪的核心是离子源离子源和和分析器分析器，其他的部分一般，其他的部分一般根据离子源和分析器相应地配备根据离子源和分析器相应地配备离子源多种多样，工作在离子源多种多样，工作在真空状态下真空状态下的有：电子轰的有：电子轰击源击源(electron bombardment,EB)、化学离子源、化学离子源(chemical Ionization,CI)、真空火花源、真空火花源(spark source,SS)、激光表面解析源、激光表面解析源(laser desorption,LD)等；工作等；工作在低压下的有辉光放电离子源在低压下的有辉光放电离子源(glow discharge,GD)；工作在大气压下的有电工作在大气压下的有电(离子离子)喷雾喷雾(electron/ion spray,E/IS)、电感耦合等离子体源、电感耦合等离子体源(inductively coupled plasma,ICP)等。
等分析器类型主要有：磁偏转、四极杆、离子阱、分析器类型主要有：磁偏转、四极杆、离子阱、飞行时间、离子回旋共振等飞行时间、离子回旋共振等不同的分析器与离子源之间有多种组合，构成了不同的分析器与离子源之间有多种组合，构成了质谱仪器庞大的家族质谱仪器庞大的家族二维质谱：二维质谱：两种不（相）同类型的质谱串联在一两种不（相）同类型的质谱串联在一起可形成二维质谱例如起可形成二维质谱例如Q-TOF MS,-TOF MS,TOF-TOF MS以及以及MSn等二维质谱在提高分析灵敏度、通量等方面具有特殊二维质谱在提高分析灵敏度、通量等方面具有特殊的优点，是蛋白质组大规模筛选的的优点，是蛋白质组大规模筛选的首选工具首选工具6.2.3 大分子电离技术大分子电离技术由于生物样品的非挥发性、热不稳定性及相对分子质量大等特性，由于生物样品的非挥发性、热不稳定性及相对分子质量大等特性，使传统的电子轰击使传统的电子轰击(EI)、化学离子源、化学离子源(CI)等电离技术的应用受到等电离技术的应用受到极大限制随着极大限制随着FAB、MALDI、ESI、ISI、大气压下碰撞电离、大气压下碰撞电离(APCI)等电离技术的出现，大大提高了质谱的测定范围，改善了等电离技术的出现，大大提高了质谱的测定范围，改善了测量灵敏度，并在一定程度上解决了溶剂分子干扰等问题，使质测量灵敏度，并在一定程度上解决了溶剂分子干扰等问题，使质谱在生物分析中的应用得到进一步的发展。
谱在生物分析中的应用得到进一步的发展表表6.1 生物质谱电离技术比较生物质谱电离技术比较目前用于生物大分子质谱分析的软电离质谱技术如下目前用于生物大分子质谱分析的软电离质谱技术如下：(1)电喷雾电离质谱电喷雾电离质谱(electrospray ionization mass spectrometry,ESI-MS);(2)基体辅助激光解吸电离质谱基体辅助激光解吸电离质谱(matrix assisted laser desorption ionization mass spectrometry,MALDI-MS)；(3)快原子轰击质谱快原子轰击质谱(fast atom bombardment mass spectrometry,FAB-MS)；(4)离子喷雾电离质谱离子喷雾电离质谱(ion spray ionization mass spectrometry,ISI-ISI-MS)；(5)大气压电离质谱大气压电离质谱(atmospheric pressure ionization mass spectrometry,API-MS)；(6)解吸电喷雾电离质谱解吸电喷雾电离质谱(desorption electrospray ionization mass spectrometry,DESI-MS)。
6.2.4 基体辅助激光解吸电离基体辅助激光解吸电离MALDI离子源可以电离分子质量为离子源可以电离分子质量为100-1000000Da的生的生物分子并用于质谱分析，提供了高的灵敏度、高的离子物分子并用于质谱分析，提供了高的灵敏度、高的离子透过率和强的可操作性透过率和强的可操作性MALDI之所以得到发展，得之所以得到发展，得益于早期试验用激光解吸及等离子体解吸生物有机分子益于早期试验用激光解吸及等离子体解吸生物有机分子的成功，也得益于的成功，也得益于FAB生物基质的进展生物基质的进展1990s在日本和在日本和德国几乎同时报道了德国几乎同时报道了60000Da分子质量的蛋白质的电离，分子质量的蛋白质的电离，引起全球的关注和兴趣，并刺激了许多公司致力于开发引起全球的关注和兴趣，并刺激了许多公司致力于开发相关质谱仪，并研究如何用相关质谱仪，并研究如何用MALDI技术分析蛋白质、技术分析蛋白质、多肽及多肽及DNAMALDI是是1988年由年由Hillenkamp 和和Micheal Karas等首等首先提出的，其原理同先提出的，其原理同FAB类似它利用激光束照射分类似它利用激光束照射分散于基体中的样品，由于这些基体（质）能够强烈吸散于基体中的样品，由于这些基体（质）能够强烈吸收激光，从而保护了样品分子。
收激光，从而保护了样品分子图图6.2 MALDI技术原理示意图技术原理示意图激光光束的能量首先被基体中的发色团吸收，随后这些激光光束的能量首先被基体中的发色团吸收，随后这些基体迅速蒸发为气相，被包含的样品分子被带入气相，基体迅速蒸发为气相，被包含的样品分子被带入气相，而离子化的产生是由于受激的基体分子将质子转移给样而离子化的产生是由于受激的基体分子将质子转移给样品分子这样离子被引入质量分析器，测量品分子这样离子被引入质量分析器，测量m/z得到质得到质谱图，并提供其离子同位素的分布信息谱图，并提供其离子同位素的分布信息MALDI-MS的实验参数包括：的实验参数包括：基体和基体基体和基体/分析物，激光功率，波长，脉冲宽度及记录分析物，激光功率，波长，脉冲宽度及记录模式模式(正离子或负离子正离子或负离子)N2激光由于在激光由于在UV段段(337nm)有较好的性能，而被广泛应有较好的性能，而被广泛应用于用于MALDI仪器中MALDI中的基体起着如下几种重要作用：中的基体起着如下几种重要作用：（1）基体相当于样品分子的）基体相当于样品分子的溶剂溶剂，样品分子被基体，样品分子被基体彼此分开，从而消弱了样品之间的相互作用；彼此分开，从而消弱了样品之间的相互作用；（2）基体分子从脉冲激光中吸收足够的能量，隔离）基体分子从脉冲激光中吸收足够的能量，隔离样品分子，提供光激发的酸或减基团，以及在离子样品分子，提供光激发的酸或减基团，以及在离子-分子碰撞中电离样品分子。
分子碰撞中电离样品分子选择选择MALDI的基体主要要求如下：的基体主要要求如下：(1)对激光有高的吸收系数；对激光有高的吸收系数；(2)与样品能够溶于同一种溶剂中；与样品能够溶于同一种溶剂中；(3)具有真空稳定性；具有真空稳定性；(4)对普遍存在于生物溶液中的无机盐及缓冲液等对普遍存在于生物溶液中的无机盐及缓冲液等 污染物具有包容性污染物具有包容性常用的基体有：常用的基体有：芥子酸芥子酸(SA)，2,5-二羟基苯甲酸，咖啡酸，吡臻酸，二羟基苯甲酸，咖啡酸，吡臻酸，安息香酸，尼古丁酸等安息香酸，尼古丁酸等MALDI-MS在基体选定后，准备样品的方法有两种：在基体选定后，准备样品的方法有两种：(1)Tanaka法：法：1987年年 Tanaka等把待测的生物样品溶于甘油中，并与很细的金属粉等把待测的生物样品溶于甘油中，并与很细的金属粉末混合，然后把悬浮液滴到探头上，让激光照射，再进入质谱分末混合，然后把悬浮液滴到探头上，让激光照射，再进入质谱分析灵敏度析灵敏度10-9 mol数量级2)Hillenkamp法：法：1988年年 Hillenkamp等认为激光解吸时是底物吸收激光，提出了等认为激光解吸时是底物吸收激光，提出了“基体辅助激光解吸基体辅助激光解吸”的概念。
将烟酸和生物样品混合溶液滴到的概念将烟酸和生物样品混合溶液滴到探头上，干燥后，用激光照射，即可得到生物分子离子信号探头上，干燥后，用激光照射，即可得到生物分子离子信号灵敏度灵敏度10-12 mol数量级，且信号强，信噪比高，被广泛采用数量级，且信号强，信噪比高，被广泛采用问题：为什么问题：为什么Tanaka获得了获得了Nobel 化学奖，而非化学奖，而非Hillenkamp?MALDI的优缺点：的优缺点：优点：优点：对样品要求低，能耐高浓度盐、缓冲剂对样品要求低，能耐高浓度盐、缓冲剂和其他非挥发性成分高灵敏度，样品量只需和其他非挥发性成分高灵敏度，样品量只需要要1pmol，甚至更少甚至更少缺点：缺点：大质量离子检测较困难离子型表面活大质量离子检测较困难离子型表面活性剂和低挥发性溶剂干扰严重，和其他进样技性剂和低挥发性溶剂干扰严重，和其他进样技术联用困难等术联用困难等MALDI可以与不同类型的检测器相互结合，特别是可以与不同类型的检测器相互结合，特别是飞行飞行时间质谱时间质谱(TOF)，即，即MALDI-TOF质谱！质谱！图6.3 The Agilent Pulsed Dynamic Focusing MALDI(PDF-MALDI)图图6.4 MALDI-TOF-MS的实际图的实际图MALDI-TOF MS中样品离子化中样品离子化将将TOF谱图转化为常规谱图转化为常规谱图谱图图图6.5 The MALDI-TOF Spectra for Poly(Propylene Glycol)摘自：Anal.Chem.,2004,76,1532-1536.RichardB.vanBreemanetal图图6.66.2.5 大气压电离质谱方法大气压电离质谱方法API-MS指在大气压下使样品有效地电离并引入与质谱的指在大气压下使样品有效地电离并引入与质谱的接口，再进行质谱分析。
接口，再进行质谱分析API-MS的工作模式：的工作模式：(1)电喷雾电喷雾(ESI)；(2)气动辅助电喷气动辅助电喷雾雾(又称离子喷雾又称离子喷雾,IS)；(3)大气压碰撞电离大气压碰撞电离(APCI)；（；（4）解吸电喷雾电离质谱解吸电喷雾电离质谱(desorption electrospray ionization Mass spectrometry,DESI-MS)API-MS 可以测定的分子可以测定的分子质量范围是质量范围是100100000Da，精度很容易达到飞克级至皮，精度很容易达到飞克级至皮克级的绝对灵敏度，可适用的化合物的范围非常广泛可克级的绝对灵敏度，可适用的化合物的范围非常广泛可与四极杆、离子阱、飞行时间质谱等组合与四极杆、离子阱、飞行时间质谱等组合可与许多进样可与许多进样技术兼容技术兼容，如，如FIA,HPLC,CE等API-MS的四种工作模式的特点：的四种工作模式的特点：(1)电喷雾电喷雾(ESI)：离子化过程应用电场来产生带电液滴，然后：离子化过程应用电场来产生带电液滴，然后 通过离子蒸发将分析物离子送入通过离子蒸发将分析物离子送入MS分析2)气动辅助电喷雾：具有上述电喷雾的特点，但最初的液滴气动辅助电喷雾：具有上述电喷雾的特点，但最初的液滴 形成是由辅气形成是由辅气(如如N2)帮助雾化的结果。
帮助雾化的结果3)大气压化学大气压化学(碰撞碰撞)电离：利用一种气态化学反应，气体溶剂电离：利用一种气态化学反应，气体溶剂 (如如CH4)作为化学离子源来电离样品作为化学离子源来电离样品4)解吸电喷雾电离解吸电喷雾电离 DESI)：是在2004年所發展出來的新电离法利用探針產生帶電液滴，接著利用高速氮氣流的攜帶來撞擊分析物表面，而從分析物表面所形成的離子再進入質譜儀作分析电喷雾的电离机理电喷雾的电离机理图图6.7 电喷雾原理示意图电喷雾原理示意图电喷雾的电离机理电喷雾的电离机理(1)小分子离子蒸发机理：在喷针针头与施加电压的电极之间形成小分子离子蒸发机理：在喷针针头与施加电压的电极之间形成 强电场该电场使液体带电，带电的液体在电场的作用下向带相强电场该电场使液体带电，带电的液体在电场的作用下向带相 反电荷的电极运动，并形成带电的液滴，由于小雾滴易分散，反电荷的电极运动，并形成带电的液滴，由于小雾滴易分散，比表面增大，在电场中迅速蒸发，结果使带电雾滴表面单位面比表面增大，在电场中迅速蒸发，结果使带电雾滴表面单位面 积的场强度高达积的场强度高达10 x108 V/cm2，从而产生液滴的，从而产生液滴的“爆裂爆裂”。
重重复该过程，最终产生分子离子复该过程，最终产生分子离子2)大分子带电残基机理：首先也是电场使溶液带电而离子化，结大分子带电残基机理：首先也是电场使溶液带电而离子化，结 果形成带电雾滴，带电的雾滴在电场作用下运动并迅速去溶，果形成带电雾滴，带电的雾滴在电场作用下运动并迅速去溶，溶液中分子所带电荷在去溶时被保留在分子上，结果形成离子溶液中分子所带电荷在去溶时被保留在分子上，结果形成离子 化的分子化的分子ESI电离的一个主要特点是可以在大气压下蒸发样电离的一个主要特点是可以在大气压下蒸发样品，离子化过程温和，产生碎片极少，是一种软电品，离子化过程温和，产生碎片极少，是一种软电离方法ESI通常可以得到多电荷分子离子，这对通常可以得到多电荷分子离子，这对于测量大分子意义重大由于大分子可以带于测量大分子意义重大由于大分子可以带10100以上电荷，因此，其质荷比大大降低，可用普通质以上电荷，因此，其质荷比大大降低，可用普通质量测定范围的质谱仪进行生物大分子分析量测定范围的质谱仪进行生物大分子分析图图6.8 电喷雾离子化过程示意图电喷雾离子化过程示意图电喷雾的一般理论电喷雾的一般理论ESI放电电压放电电压(V0)与表面张力与表面张力(Ts)、毛细管半径、毛细管半径(r)及及针尖与采样板间距离针尖与采样板间距离(h)的关系可用下式表示：的关系可用下式表示：04lnshVT rr(6.1)在实验中虽然并不用它来进行计算，但却可以定性地在实验中虽然并不用它来进行计算，但却可以定性地帮助理解电喷雾的条件。
帮助理解电喷雾的条件ESI产生多电荷离子，在电离过程中，喷雾中颗粒带产生多电荷离子，在电离过程中，喷雾中颗粒带电荷数电荷数q为：为：(6.2)式中：式中：表示溶液的表面张力常数表示溶液的表面张力常数 o表示介电常数表示介电常数 rs表示液滴的半径表示液滴的半径电喷雾离子一般每多电喷雾离子一般每多1000相对分子质量可以多带一相对分子质量可以多带一个电荷30s8qr 影响影响ESI过程的因素过程的因素由于电喷雾过程非常复杂，影响因素有：由于电喷雾过程非常复杂，影响因素有：(1)离子化与否主要与被分析分子的离子化与否主要与被分析分子的pKa值和溶液的值和溶液的 pH有关；有关；(2)喷雾状态与表面张力和黏度有关，另外，与是否喷雾状态与表面张力和黏度有关，另外，与是否 有气动辅助喷雾也有关有气动辅助喷雾也有关(喷雾量较大时喷雾量较大时)；(3)去溶好坏与干燥气体的温度和流量有关，并与溶去溶好坏与干燥气体的温度和流量有关，并与溶 剂的蒸发热剂的蒸发热 Hvap有关；有关；(4)离子的解吸与它的溶解热离子的解吸与它的溶解热(气态气态)有关；有关；(5)气相反应与质子亲和势和电荷交换速度有关气相反应与质子亲和势和电荷交换速度有关。
ESI电离的优点：电离的优点：(1)被检测分子变成气相离子时没有受到外部能量的激发，因被检测分子变成气相离子时没有受到外部能量的激发，因而不会发生裂解，没有碎片峰，因此谱图解析相对简单；而不会发生裂解，没有碎片峰，因此谱图解析相对简单；(2)对于多级质谱，通过碰撞诱导裂解（对于多级质谱，通过碰撞诱导裂解（CID）可以产生碎片，）可以产生碎片，从而提供分子的结构信息电喷雾质谱不仅能够产生多电荷离从而提供分子的结构信息电喷雾质谱不仅能够产生多电荷离子、对某些极性物质电离效率高（对蛋白质接近子、对某些极性物质电离效率高（对蛋白质接近100%），而），而且具有软电离等特性，因而成为极性化合物（包括溶液中的离且具有软电离等特性，因而成为极性化合物（包括溶液中的离子），热稳定性差和高分子量化合物分析最有效的工具之一子），热稳定性差和高分子量化合物分析最有效的工具之一3)在常规电喷雾电离技术中，喷雾过程容易形成较大液滴，液在常规电喷雾电离技术中，喷雾过程容易形成较大液滴，液滴中的样品分子不能完全离子化，因而降低了样品的利用率和滴中的样品分子不能完全离子化，因而降低了样品的利用率和质谱检测灵敏度近几年发展起来的纳升电喷雾方法质谱检测灵敏度。
近几年发展起来的纳升电喷雾方法(Nanospray)，采用内径为，采用内径为10 m左右的喷针，样品注入到喷针左右的喷针，样品注入到喷针的喷口，在喷口前端产生喷雾，喷雾液滴比常规电喷雾产生的的喷口，在喷口前端产生喷雾，喷雾液滴比常规电喷雾产生的小小100倍，这样可以使样品被充分利用，并有效离子化与常规倍，这样可以使样品被充分利用，并有效离子化与常规电喷雾电离技术相比，电喷雾电离技术相比，Nanospray流量极低，样品消耗量极少，流量极低，样品消耗量极少，灵敏度可以达到灵敏度可以达到fmol图图6.9 电喷雾质谱仪电喷雾质谱仪图图6.10 典型的电喷雾质谱图典型的电喷雾质谱图6.3液相色谱质谱联用液相色谱质谱联用作为化学领域最强有力的分离分析技术之一，自上世纪作为化学领域最强有力的分离分析技术之一，自上世纪70年代以年代以来，液相色谱来，液相色谱(LC)，特别是高效液相色谱（，特别是高效液相色谱（HPLC）得到了迅速）得到了迅速的发展，无论在色谱基础理论，还是在仪器性能方面都得到了很的发展，无论在色谱基础理论，还是在仪器性能方面都得到了很大程度的提高和完善随着应用领域的不断拓展，大程度的提高和完善。
随着应用领域的不断拓展，LC在环境分在环境分析、生化分析、医药分析和药物质量控制等方面的应用也越来越析、生化分析、医药分析和药物质量控制等方面的应用也越来越广泛，尤其是随着生命科学研究的不断深入，广泛，尤其是随着生命科学研究的不断深入，LC已经成为一种已经成为一种极为重要和必不可少的分离分析手段极为重要和必不可少的分离分析手段LC虽然在复杂样品分析中显示出很高的分离效率，而且定量准虽然在复杂样品分析中显示出很高的分离效率，而且定量准确，但其确，但其定性分析能力却较为薄弱定性分析能力却较为薄弱，通常仅仅是根据各组分的，通常仅仅是根据各组分的保留特性来定性，这在复杂样品分析中，尤其在未知组分的定性保留特性来定性，这在复杂样品分析中，尤其在未知组分的定性分析中具有一定的难度（可信度差和无标准品）分析中具有一定的难度（可信度差和无标准品）6.3.1 概述概述然而，随着一些新的定性分析手段的出现，尤其是质谱仪器的然而，随着一些新的定性分析手段的出现，尤其是质谱仪器的发展，对一些组分相对简单的样品进行定性分析已经变得比较发展，对一些组分相对简单的样品进行定性分析已经变得比较容易质量是物质的固有特征之一质量是物质的固有特征之一，质谱分析中，表现为不同荷质比，质谱分析中，表现为不同荷质比的化合物对应不同的离子谱峰，由此，根据质谱分析结果可以的化合物对应不同的离子谱峰，由此，根据质谱分析结果可以获得被分析物的分子量，从而实现对各物质进行定性分析，另获得被分析物的分子量，从而实现对各物质进行定性分析，另外，离子谱峰的强度与其所代表的化合物含量有一定关系，所外，离子谱峰的强度与其所代表的化合物含量有一定关系，所以，利用这一点可以对各物质进行半定量分析。
以，利用这一点可以对各物质进行半定量分析质谱分析虽然具有灵敏度高、鉴别能力强等优点，但是由于离质谱分析虽然具有灵敏度高、鉴别能力强等优点，但是由于离子抑制效应等的影响在复杂样品定性分析中却具有一定困难子抑制效应等的影响在复杂样品定性分析中却具有一定困难由此可以看出，如果把由此可以看出，如果把LC分离和质谱分析有机结合起来，充分分离和质谱分析有机结合起来，充分发挥它们各自的优点，取长补短，就可以有效的对复杂样品进发挥它们各自的优点，取长补短，就可以有效的对复杂样品进行定性和定量分析，因此，行定性和定量分析，因此，LC-质谱联用技术逐渐被广大科研质谱联用技术逐渐被广大科研工作者所关注工作者所关注液相色谱液相色谱-质谱联用技术的研究始于质谱联用技术的研究始于20世纪世纪70年代，年代，90年代以后，由于大气压电离技术的出现和成功年代以后，由于大气压电离技术的出现和成功应用以及质谱本身的发展，液相色谱与质谱的联应用以及质谱本身的发展，液相色谱与质谱的联用得到了极大的重视和发展液相色谱用得到了极大的重视和发展液相色谱-质谱联用质谱联用技术将液相色谱的技术将液相色谱的高分离效能和质谱的高灵敏度高分离效能和质谱的高灵敏度及较强的结构解析能力及较强的结构解析能力有机的结合在一起，样品有机的结合在一起，样品经过液相色谱分离后，借助质谱分析结果进行鉴经过液相色谱分离后，借助质谱分析结果进行鉴定，开辟了复杂样品分离和检测的新天地。
定，开辟了复杂样品分离和检测的新天地串联质谱（串联质谱（MS/MS，Tandem MS,MSn）技术是）技术是质谱分析中的重要联用技术，不仅可以给出样品质谱分析中的重要联用技术，不仅可以给出样品分子量的相关信息，而且还可以给出有关样品结分子量的相关信息，而且还可以给出有关样品结构的丰富信息串联质谱（构的丰富信息串联质谱（MS/MS）技术包括三）技术包括三个过程：即用来进行质量分离的第一级质谱个过程：即用来进行质量分离的第一级质谱（MS1），碰撞活化离解和用来进行质谱检测的），碰撞活化离解和用来进行质谱检测的第二级质谱（第二级质谱（MS2）其中碰撞活化离解是使运）其中碰撞活化离解是使运动中的离子和中性惰性气体进行碰撞、继而发生动中的离子和中性惰性气体进行碰撞、继而发生碰撞活化离解的过程碰撞活化离解的过程另外，液相色谱与单级质谱联用（另外，液相色谱与单级质谱联用（LC-MS）虽然已经具有足够高的灵敏度，但是仅能提虽然已经具有足够高的灵敏度，但是仅能提供分子量信息，而液相色谱与多级质谱联用供分子量信息，而液相色谱与多级质谱联用（LC-MS/MS）则可提供分子结构的信息，）则可提供分子结构的信息，此外，通过此外，通过MS/MS的选择反应控制模式的选择反应控制模式(SRM)或多反应检测模式或多反应检测模式(MRM)可以提高可以提高信噪比，在复杂样品分析时仍可达到很高的信噪比，在复杂样品分析时仍可达到很高的灵敏度。
灵敏度6.3.2 液相色谱液相色谱-质谱联用接口技术质谱联用接口技术例如例如HPLC与与MS接口的主要问题接口的主要问题（1）HPLC流出物如果全部流出物如果全部气化，可产生气化，可产生5001000 mL/min的气体，而的气体，而MS采样仅能接受采样仅能接受1050 mL/min的气体；（的气体；（2）通用的气相电离方法一般不适用）通用的气相电离方法一般不适用于于HPLC分离后的化合物（具有热不稳定性、极性和较高分子分离后的化合物（具有热不稳定性、极性和较高分子量）为实现液相色谱与质谱的联用，需要解决液相色谱流动相对为实现液相色谱与质谱的联用，需要解决液相色谱流动相对质谱工作条件的影响的问题，为此可以通过以下两个途径实质谱工作条件的影响的问题，为此可以通过以下两个途径实现：现：一是发展不同接口以协调一是发展不同接口以协调LC和和MS的不同要求；的不同要求；二是改进液相色谱技术，如发展微柱液相色谱，减少进入质二是改进液相色谱技术，如发展微柱液相色谱，减少进入质谱流动相的量，改进质谱的离子化方法，使它们两者之间逐谱流动相的量，改进质谱的离子化方法，使它们两者之间逐渐靠近液相色谱液相色谱-质谱联用的实现，质谱联用的实现，接口技术接口技术一度成为其发展一度成为其发展的瓶颈。
在接口研制方面，前后共发展了的瓶颈在接口研制方面，前后共发展了20多种技术，多种技术，其中主要有直接导入接口（其中主要有直接导入接口（DLI）、移动带接口）、移动带接口（MB）、热喷雾接口（）、热喷雾接口（ES）、粒子束接口（）、粒子束接口（PB）、）、和快原子轰击（和快原子轰击（FAB）等，但这些技术都不同程度的）等，但这些技术都不同程度的存在一些方面的限制和缺陷近几年来，随着一系列存在一些方面的限制和缺陷近几年来，随着一系列质谱软电离技术的实现和发展，尤其是随着大气压离质谱软电离技术的实现和发展，尤其是随着大气压离子化接口子化接口(API)技术和基体辅助激光解吸离子化接口技术和基体辅助激光解吸离子化接口（MALDI）技术的不断成熟和完善，液相色谱）技术的不断成熟和完善，液相色谱-质谱质谱联用技术不仅得到了突破性的进展，而且在生命科学联用技术不仅得到了突破性的进展，而且在生命科学中的应用也得到了前所未有的拓展中的应用也得到了前所未有的拓展理想的理想的LC-MS接口应具有如下的特点：接口应具有如下的特点：（1）高效率的样品转移，可接受的样品转移精度；）高效率的样品转移，可接受的样品转移精度；（2）可适应不同的）可适应不同的LC方法；方法；（3）可适应不同的质谱操作条件；）可适应不同的质谱操作条件；（4）样品在转移过程中不被分解损失；）样品在转移过程中不被分解损失；（5）高速、方便可靠，对操作人员的技术要求不高。
高速、方便可靠，对操作人员的技术要求不高6.3.2.1 大气压离子化接口技术大气压离子化接口技术大气压离子化接口是指离子化在常压下进行的大气压离子化接口是指离子化在常压下进行的接口，是目前液相色谱接口，是目前液相色谱-质谱联用技术中应用质谱联用技术中应用范围最广的一种接口范围最广的一种接口APIAPI主要包括电喷雾电主要包括电喷雾电离（离（ESIESI）和大气压化学电离（）和大气压化学电离（APCIAPCI）两种）两种操作模式操作模式该电离技术利用位于一根毛细管和质谱仪进口间的电势差生成离子，在电场的作用下产生以喷雾形式存在的带电液滴，当使用干燥气体或者加热时，溶剂蒸发，带电液滴体积缩小，电场增强，离子向液滴表面移动并从表面挥发，最终生成单电荷或多电荷去溶剂化离子通常情况下，小分子生成M+H+或M-H-单电荷离子，生物大分子产生多电荷离子图图6.11 电喷雾电离电喷雾电离接口示意图接口示意图图图6.12 大气压化学电离接口示意图大气压化学电离接口示意图是将化学电离原理延伸到大气压下进行的一种新的软电离技是将化学电离原理延伸到大气压下进行的一种新的软电离技术样品溶液从术样品溶液从LCLC流出，进入具有雾化气套管的毛细管后，流出，进入具有雾化气套管的毛细管后，被氮气流雾化，然后在通过加热管时被气化，气化后的溶剂被氮气流雾化，然后在通过加热管时被气化，气化后的溶剂分子在加热管端的电晕放电探针处形成反应气等离子体，样分子在加热管端的电晕放电探针处形成反应气等离子体，样品分子通过与反应气等离子体进行质子交换被电离，形成准品分子通过与反应气等离子体进行质子交换被电离，形成准分子离子分子离子M+HM+H+或或M-HM-H-，最后，样品分子的准分子离子通，最后，样品分子的准分子离子通过筛选狭缝进入质谱仪，整个过程在过筛选狭缝进入质谱仪，整个过程在大气压条件下完成大气压条件下完成。
APCIAPCI（大气压化学电离）也是一种软电离接口（大气压化学电离）也是一种软电离接口技术，电离过程中只产生单电荷峰，非常适合技术，电离过程中只产生单电荷峰，非常适合弱极性小分子化合物的测定，另外，弱极性小分子化合物的测定，另外，APCIAPCI还与还与高流量的梯度洗脱和高低水溶液变换的流动相高流量的梯度洗脱和高低水溶液变换的流动相兼容，通过调节离子源电压，可以得到不同断兼容，通过调节离子源电压，可以得到不同断裂程度的质谱图裂程度的质谱图无套流无套流CE-ESI 接口接口nLC-ESI 接口接口Z喷雾喷雾ESI源源图图6.13 直接将直接将CE与与ESI-MS连接的连接的 接口设计接口设计6.3.2.2 LC与与MALDI接口技术接口技术LC与与MALDI的联用目前正在发展中，从离子化的联用目前正在发展中，从离子化的原理看，存在一些实际困难！的原理看，存在一些实际困难！作为分离科学领域中最强有力的分离分析工具之一，液相色谱对作为分离科学领域中最强有力的分离分析工具之一，液相色谱对组分相对简单样品的分离采用一维分离模式完成，但是对于一些组分相对简单样品的分离采用一维分离模式完成，但是对于一些组分复杂的样品而言，如果仅采用一维色谱分离模式，无论怎样组分复杂的样品而言，如果仅采用一维色谱分离模式，无论怎样优化色谱分离条件，也无法使所有的组分都能达到满意的分离。
优化色谱分离条件，也无法使所有的组分都能达到满意的分离DavisDavis等曾经指出等曾经指出:只用一维分离方法对含有只用一维分离方法对含有100100个随机分布组分个随机分布组分的样品进行分离，完全分离其中的的样品进行分离，完全分离其中的8282个组分大约需要四百万理论个组分大约需要四百万理论塔板数显然，期望具有如此之高柱效的色谱柱在目前看来是不塔板数显然，期望具有如此之高柱效的色谱柱在目前看来是不切合实际的而与一维色谱相比，近几年来得到迅速发展和广泛切合实际的而与一维色谱相比，近几年来得到迅速发展和广泛应用的多维液相色谱应用的多维液相色谱(Multidimensional high-performance(Multidimensional high-performance liquid chromatographyliquid chromatography，MDLC)MDLC)不仅能够提供更大的峰容量，而不仅能够提供更大的峰容量，而且还具有分离样品动态范围宽、分辨率高和自动化程度高等优点，且还具有分离样品动态范围宽、分辨率高和自动化程度高等优点，它的出现不仅很好的解决了复杂样品的分离分析问题，而且大大它的出现不仅很好的解决了复杂样品的分离分析问题，而且大大提高了液相色谱的分离能力和选择性。
因此，多维液相色谱与质提高了液相色谱的分离能力和选择性因此，多维液相色谱与质谱联用也越来越被重视并得到迅速发展，所以，根据联用体系中谱联用也越来越被重视并得到迅速发展，所以，根据联用体系中液相色谱的维数多少，液相色谱液相色谱的维数多少，液相色谱-质谱联用技术又可以分为一质谱联用技术又可以分为一维液相色谱维液相色谱-质谱联用模式和多维液相色谱质谱联用模式和多维液相色谱-质谱联用模质谱联用模式图图6.14 多维液相色谱分离模式多维液相色谱分离模式(a)2D-SEC-RPLC-MS;(b)多维多维蛋白质识别技术蛋白质识别技术SEC尺寸排阻色谱尺寸排阻色谱RPLC反相色谱反相色谱column 2 column 1 sample loop 2 sample loop 1 waste computer UV detector MS detector pump 1 pump 2 图图6.15 6.15 全二维液相色谱全二维液相色谱-质谱联用装置原理示意图质谱联用装置原理示意图abc图图6.16 6.16 川芎甲醇提取液的二维分离色谱图川芎甲醇提取液的二维分离色谱图 6.4电化学光谱联用电化学光谱联用电化学技术主要涉及电流、电势和电量的变化，在工农业和日电化学技术主要涉及电流、电势和电量的变化，在工农业和日常生活中发挥重要作用常生活中发挥重要作用(葡萄糖传感器和各种电池葡萄糖传感器和各种电池)，但采用电化，但采用电化学技术很难得到物质结构方面的信息。
因此，有必要将电化学技学技术很难得到物质结构方面的信息因此，有必要将电化学技术和其他方法进行联用术和其他方法进行联用与电化学技术联用的方法最常见的是各种光谱学技术这些技术与电化学技术联用的方法最常见的是各种光谱学技术这些技术分为现场分为现场(in situ)和非现场和非现场(ex situ)方法现场方法是在控制电势方法现场方法是在控制电势或电流时考察电解池溶液中的电极表面；在采用非现场技术时，或电流时考察电解池溶液中的电极表面；在采用非现场技术时，电极是从电化学池中拿走，然后进行测量，经常是在空气或真空电极是从电化学池中拿走，然后进行测量，经常是在空气或真空中进行在此主要讨论现场方法在此主要讨论现场方法6.4.1 与紫外和可见光谱联用与紫外和可见光谱联用图图6.17 6.17 透射光谱电化学实验装置示意图透射光谱电化学实验装置示意图光透电极光透电极(optically transparent electrode,OTE)(optically transparent electrode,OTE)A 透射实验透射实验图图6.18(a)6.18(a)用于半无限扩散实验的透射光谱电化学池光束从用于半无限扩散实验的透射光谱电化学池。
光束从垂直方向通过；垂直方向通过；(b)(b)光透薄层体系：正视和侧视图光透薄层体系：正视和侧视图图图6.19 6.19 采用在采用在SnOSnO2 2 OTE OTE电极上电极上产生甲基紫精自由基的电量滴定产生甲基紫精自由基的电量滴定细胞色素细胞色素c c和细胞色素和细胞色素c c氧化酶在溶液中，一个在溶液中，一个甲基紫精自由基甲基紫精自由基可还原细胞色素可还原细胞色素c c中的一个血红素中的一个血红素或细胞色素或细胞色素c c氧化酶中的两个血红氧化酶中的两个血红素中的一个实验结果表明细胞素中的一个实验结果表明细胞色素色素c c氧化酶中的一个血红素基团氧化酶中的一个血红素基团首先被还原，然后甲基紫精自由首先被还原，然后甲基紫精自由基在还原细胞色素基在还原细胞色素c c氧化酶中的第氧化酶中的第二个血红素之前，还原细胞色素二个血红素之前，还原细胞色素c c中的血红素中的血红素6.4.2 与振动光谱的联用与振动光谱的联用A 红外光谱红外光谱在红外光谱电化学在红外光谱电化学(infrared spectroelectrochemistry,IR-SEC)中，中，被探测物质在电极表面和距电极表面很薄的溶液层中。
常用的外被探测物质在电极表面和距电极表面很薄的溶液层中常用的外反射模式如图反射模式如图6.20所示IR辐射辐射窗口窗口薄溶液层薄溶液层图图6.20 6.20 红外光谱电化学的外反射示意图红外光谱电化学的外反射示意图图图6.21 IR-SEC6.21 IR-SEC的光谱电化学池的光谱电化学池由于大多数溶剂对红外辐射有较强的吸收，所以窗口和电极之间由于大多数溶剂对红外辐射有较强的吸收，所以窗口和电极之间的溶液薄层必须很小的溶液薄层必须很小(1-100 nm)为了得到有用的信号，通常采为了得到有用的信号，通常采用对电势或入射光进行调制用对电势或入射光进行调制电势调制红外技术称为电势调制红外技术称为EMIRS，即，即电化学调制红外反射光谱法电化学调制红外反射光谱法(electrochemically modulated infrared spectroscopy)图图6.22 EMIRS6.22 EMIRS实验的仪器方框图实验的仪器方框图振荡器改变电极电势，并且为振荡器改变电极电势，并且为相敏检测器相敏检测器(PDS)(PDS)提供一个参比信号检测器调制的提供一个参比信号检测器调制的IRIR信号也反馈到信号也反馈到PDSPDS。
大多数现代大多数现代IR光谱仪具备光谱仪具备Fourier变换的多种优点相应的变换的多种优点相应的IR-SEC技术是技术是SNIFTIRS，即差减归一化界面，即差减归一化界面Fourier变换红外光谱法变换红外光谱法(Substractively normalized interfacial Fourier transform infraredspectroscopy)图图6.23 SNIFTIRS6.23 SNIFTIRS仪器的方框图仪器的方框图光源、干涉仪、检测器和数据存取通常与一个商品化的光源、干涉仪、检测器和数据存取通常与一个商品化的FTIRFTIR仪器相同仪器相同 引自引自 J.K.J.K.Foley,C.Korzeniewski,J.L.Daschbach and S.Pons,Electroanal.Chem.,14,Foley,C.Korzeniewski,J.L.Daschbach and S.Pons,Electroanal.Chem.,14,309(1986)309(1986)图图6.24 6.24 在不同的波数区域和在在不同的波数区域和在1mol/L HClO1mol/L HClO4 4溶液中对溶液中对-二氯苯二氯苯在在PtPt电极上的电极上的SNIFTIRSSNIFTIRS光谱图。
光谱图每条曲线是在每条曲线是在0.2 V0.2 V和和0.4 V(0.4 V(相对于相对于NHE)NHE)处记录的光谱的差值负峰相应于在处记录的光谱的差值负峰相应于在0.4 V0.4 V处处的特征主峰，正峰相应于在的特征主峰，正峰相应于在0.2 V0.2 V处的特征主峰处的特征主峰B 拉曼光谱拉曼光谱拉曼光谱提供与拉曼光谱提供与IR光谱互补的分子振动信息由于激发和测量均光谱互补的分子振动信息由于激发和测量均在可见光区，电化学池可采用玻璃窗和水溶液在可见光区，电化学池可采用玻璃窗和水溶液(两者均对红外有强两者均对红外有强吸收吸收)拉曼散射的概率取决于一些确定的选择规律，但在大多数拉曼散射的概率取决于一些确定的选择规律，但在大多数情况下是很低的，因此实验必须采用强光源和较高的样品浓度情况下是很低的，因此实验必须采用强光源和较高的样品浓度图图6.25 6.25 具有激光激发和电荷偶合装置具有激光激发和电荷偶合装置(charge-coupled device,(charge-coupled device,CCD)CCD)作为检测器的作为检测器的RamanRaman光谱仪的方框图光谱仪的方框图当分子吸附在特定的表面当分子吸附在特定的表面(例如银或金例如银或金)时，拉曼效应可以得到时，拉曼效应可以得到很大的增强，据此所发展的方法称为表面增强拉曼光谱法很大的增强，据此所发展的方法称为表面增强拉曼光谱法(surface enhanced Raman spectroscopy,SERS)。
SERS的的Raman信号增强信号增强105106倍图图6.26 6.26 在波长在波长514.5 nm514.5 nm激光激发下，在三种不同波长区内测激光激发下，在三种不同波长区内测得的吸附在得的吸附在AgAg电极上的电极上。