单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,#,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,#,柠檬酸发酵机制,重点：,柠檬酸生物合成途径；柠檬酸生物合成的代谢调节机制难点：,柠檬酸生物合成的代谢调节机制1,一、柠檬酸简介,柠檬酸又名枸橼酸，学名,-,羟基丙烷三羧酸，是生物体主要代谢产物之一化学名称,2-,羟基丙三羧酸，英文文献俗名,citric acid,，分子式,C,6,H,8,O,7,无色或白色晶体，无臭，味极酸，易溶于水和乙醇、微溶于乙醚、水溶液呈酸性反应第一节 概述,2,食品工业：,酸味剂、增溶剂、抗氧化剂，除腥脱臭剂；,医药工业：,化学工业：,美容品、化妆品,二、柠檬酸及其盐的应用概况,3,三、我国柠檬酸生产现状,生产状况：,60,年代开始，生产柠檬酸年总产量居世界第一，出口量一直占国内总产量的,50%,以上目前，生产厂家近百家，万吨级以上的有,6,家主要有,安徽丰原生物化学集团公司,（生产能力为,12.0,万吨,/,年）、,江苏无锡罗氏中亚柠檬酸有限公司,（生产能力为,4.0,万吨,/,年）、,安徽华源生物药业有限公司,（生产能力为,3.5,万吨,/,年）等。
存在问题：,出口量增长过快，技术创新相对滞后，加上国际市场竞争激烈，已出现严重的供大于求的局面，设备利用率不到,60%,，行业经济效益呈滑坡态势4,5,第二节 柠檬酸合成途径与代谢调控,1940,年，,Krebs:TCA,；,1953,年，,Jagnnathan,证实黑曲霉中存在,EMP,途径所有酶；,1954,年，,Shu,提出葡萄糖,80%,经,EMP,途径代谢；,1954-1955,年，,Ramakrishman,等发现黑曲霉中存在,TCA,循环一、柠檬酸合成途径的发现,6,二、黑曲霉柠檬酸生物合成途径,7,黑曲霉利用糖类发酵生成柠檬酸其生物合成途径是，葡萄糖经,EMP,、,HMP,途径降解生成丙酮酸，丙酮酸一方面氧化脱羧生成乙酰,CoA,，另一方面经,CO,2,固定化反应生成草酰乙酸，草酰乙酸与乙酰,CoA,缩合生成柠檬酸1),生长期与产酸期都存在,EMP,与,HMP,途径，前者,EMP:HMP=2:1,，后者,EMP:HMP=4,：,1,(2),黑曲霉柠檬酸产生菌中存在,TCA,循环与乙醛酸循环，在以糖质原料发酵时，当柠檬酸积累时，,TCA,和乙醛酸循环被,阻断或减弱,3),由于,TCA,和乙醛酸循环被阻断或减弱，,草酰乙酸,是由丙酮酸（,PYR,）或磷酸烯醇式丙酮酸（,PEP,）羧化生成的。
即由两个,CO,2,固定化反应体系，其中以丙酮酸羧化酶作用下固定化,CO,2,生成草酰乙酸为主8,三、柠檬酸生物合成的代谢调节机制,9,1,、磷酸果糖激酶（,PFK,）：,（一）糖酵解及丙酮酸代谢的调节,Mn,2+,浓度对磷酸果糖激酶的影响,Mn,2+,缺乏为何会使,NH,4,+,浓度升高呢,？,当培养基中,Mn,2+,缺乏时，微生物体内积累几种氨基酸（,GA,、,GLu,、,Arg,、,Oin,等），这些氨基酸的积累，意味着体内蛋白质的合成受阻，而外源蛋白质的分解速度则不受到影响，这样,NH,4,+,的消耗下降，,NH,4,+,浓度就会升高10,2,、丙酮酸羧化酶：,催化生成草酰乙酸3,、丙酮酸脱氢酶：,催化生成乙酰,CoA,11,（二）三羧酸循环的调节,1,、柠檬酸合成酶的调节：,柠檬酸合成酶是,TCA,循环第一个酶但黑曲霉中柠檬酸合成酶没有调节作用2,、顺乌头酸水合酶、异柠檬酸脱氢酶的调节：,顺乌头酸水合酶、,NAD,和,NADP-,异柠檬酸脱氢酶,在柠檬酸产生与不产生时，这,3,种酶均存在，而当铜离子,0.3mg/L,，铁离子,2mg/L,和,pH2.0,情况下，这,3,种酶均不出现活力，发酵中柠檬酸正是在这个,pH,条件下积累的。
顺乌头酸水合酶,是催化柠檬酸,顺乌头酸,异柠檬酸正逆反应的酶，研究表明，黑曲霉中有一种单纯的位于线粒体上的顺乌头酸水合酶，它在催化时能建立下面的平衡：柠檬酸,:,顺乌头酸,:,异柠檬酸,90:3:7,12,3,、,-,酮戊二酸脱氢酶的调节,在黑曲霉柠檬酸产生菌中，,TCA,循环的一个显著特点是，,-,酮戊二酸脱氢酶的合成受葡萄糖和铵离子的阻遏因此当以葡萄糖为碳源时，在柠檬酸生成期，菌体内不存在,-,酮戊二酸脱氢酶或活力很低酮戊二酸脱氢酶催化的反应是,TCA,循环中唯一不可逆反应，一旦,-,酮戊二酸脱氢酶丧失，就会引起：,TCA,循环中的苹果酸、富马酸、琥珀酸是由草酰乙酸逆,TCA,循环生成，使,TCA,循环成,“,马蹄形,”,酮戊二酸又抑制异柠檬酸脱氢酶的活性13,(,三,),氧对柠檬酸积累的调节,乙酰,CoA,和草酰乙酸结合生成柠檬酸过程中要引进一个氧原子，因此氧也可以看作为柠檬酸生物合成底物它对柠檬酸发酵的作用为：,(1),氧是发酵过程生成的,NADH2,重新氧化的氢受体2),近来的研究发现，黑曲霉中除了具有一条标准呼吸链以外，还有一条侧系呼吸链当缺氧时，只要很短时间中断供氧，就会导致此侧系呼吸链的不可逆失活，而导致柠檬酸产酸急剧下降。
14,（四）乙醛酸循环与醋酸发酵柠檬酸,乙醇,乙酸,3,醋酸,1,柠檬酸,生成的柠檬酸一半转化为异柠檬酸,酵母,N,源耗尽后开始烷烃发酵，低浓度,AMP,抑制,NAD-,异柠檬酸脱氢酶的活性，柠檬酸大量合成并积累此时顺乌头酸水合酶催化反应平衡为：柠檬酸：异柠檬酸：顺乌头酸,=90,：,7,：,3,细胞质中积累大量异柠檬酸15,Mn,2+,缺乏抑制蛋白合成,NH,4,+,，有一条呼吸活动强的不产生,ATP,的侧呼吸链：,解除磷酸果糖激酶的代谢调节,，,促进,EMP,途径畅通丙酮酸羧化酶是组成型酶，不被调节控制丙酮酸氧化脱羧生成乙酰,CoA,和,CO,2,的固定两个反应的平衡，以及柠檬酸合成酶不被调节，增强了合成柠檬酸的能力小结：,顺乌头酸水合酶在催化时建立了以下平衡：,柠檬酸：顺乌头酸：异柠檬酸,=90,：,3,：,7,同时控制,Fe,2+,含量时，顺乌头酸酶活力降低，使柠檬酸积累随着柠檬酸积累，,pH,降低到一定程度时，使顺乌头酸酶和异柠檬酸脱氢酶失活，更有利于柠檬酸的积累16,（五）柠檬酸发酵的产率,1,、无,CO,2,固定反应的产率,合成,1,分子柠檬酸需要,3,分子乙酰辅酶,A,，也就是需要,1.5,分子的葡萄糖。
理论产率为：,192/(1801.5)=71.1%,17,2,、通过,CO,2,固定反应提供,C,4,二羧酸,18,四、柠檬酸发酵过程的控制要点,（,1,）控制,Mn,2+,、,NH,4,+,浓度，解除柠檬酸对,PFK,的抑制，使,EMP,畅通无阻3,）控制培养基中的,Fe,2+,的浓度，使顺乌头酸水合酶失活2,）控制溶氧，防止侧系呼吸链失活19,五、柠檬酸产生菌育种的传统方法：,1.,透明圈大的菌株,平板：,10%,甘薯,+2%,的琼脂,+0.5%CaCO,3,诱变后，涂布，透明圈大的则好,2.,显色圈大小,平板：麦汁培养基,+pH,值指示剂 诱变后，,33,培养,3,天，透明圈大的则好20,3.,不分解柠檬酸的菌株,不利用柠檬酸为碳源的菌株，说明其,TCA,循环中柠檬酸后续酶的活性较低，或者丧失，这有利于积累柠檬酸方法：以柠檬酸为唯一碳源的培养基上生长不好的突变株4.,选育不长孢子、少长孢子、迟长孢子的菌株,在培养基中如果菌株能够大量合成积累柠檬酸，自然会使,TCA,循环中的中间产物浓度降低，这样不利于孢子的形成为何？中间产物少，,C,架少，不利于合成代谢,）,21,思考题,1.,柠檬酸发酵过程中有哪几个控制要点，如何控制？,2.,说明柠檬酸发酵过程中氧的重要性。
3.,简述二氧化碳固定反应对提高柠檬酸产率的意义。