蛋白氮与非蛋白氮区分检测规程A、 非蛋白氮的概述非蛋白氮大致可以分为以下几类，①尿素及其衍生物类，如缩二脲、羟甲基尿素等；②氨态 氮类，如液氨、氨水等；③铵类，如硫酸铵、氯化铵等；④肽类及其衍生物，包括氨基酸、 酰胺、胺等；⑤动物粪便及其它废弃物类以下是几种常见的非蛋白氮的介绍： 双缩脲又称缩二脲，是一种尿素缩合产品，其含氮量在35%上，蛋白质当量为219%缩二脲难溶 于水，一般的定量检验方法为紫红色配位化合物比色法（原理：鱼粉中的双缩脲经抽提后， 在酒石酸钠的碱性溶液中与硫酸铜生成紫红色配位化合物，在550nm波长下比色从而测出 其含量）尿素是氮和二氧化碳在高温高压下化合而成纯尿素的含氮量为 47 %，折合蛋白当量为293. 75%易潮解，易溶于水，一般的定量检验方法有二种：一种为二甲基氨基苯甲醛显 色法；另一种为二嗪衍生物显色法但以上两种方法只能测定游离性尿素而不能测定其衍生 物尿素甲醛聚合物是由尿素和甲醛聚合而成，其含氮量为38.89%，折合蛋白当量为243. 06%该聚合物难 溶于水硫酸铵俗称肥田粉，其含氮量为20%左右，折合蛋白当量为125%硫酸铵的工业品一般为白色或 微带黄色的结晶，易溶于水，其分子式为（NH 4 ） 2 SO 4。
异亚丁基二脲又名二脲异丁烷，简称IBDU，为尿素和异丁醛在催化剂的作用下综合反应生成IBDU为 一种子的白色粉末或颗粒，总含氮量为32. 18%，折合蛋白当量为201.13%，吸湿度远低 于尿素以上是比较常见的非蛋白氮物质随着科技的发展，还会有越来越多的非蛋白氮物质被合成 出来，从而使反刍动物所用的非蛋白氮使用广泛，而掺假者很容易将此物质掺入饲料原料中 以提高原料的粗蛋白质B、 非蛋白氮的检验1、非蛋白氮的定性检验在对原料样品的检测中，一般有定性检测和定量检测在定性检测中，使用的比较多的为显 微镜检，包括直接镜检、分层镜检（用四氯化碳或三氯甲烷分层）、反应剂镜检（用化学物 质和样品中的某些物质反应而在显微下区分）、染色镜检等在使用的过程中，往往使用一 项或多项镜检方法对样品中的物质进行判定对于非蛋白氮的检验，显微镜检是一种比较有效的方法在对样品的检测中，一般使用的是 生物显微镜，其放大的倍数在36〜400倍之间，为了获得更好的显微效果，可以根据实际情 况作出具体的调整以下是镜检使用过程中的一些技巧：直接镜检直接镜检一般所用的倍数比较小，通过对样品不同的物理特征，如颜色、透明度、表面组织、 形状等物理性状进行判定。
特别的要与典型的样品进行比较，以便能够更好区分样品与杂质 的不同在直接镜检中，用不同的滤光片有时可以起到比较明显的效果虽然直接镜检比较 方便和直观，但有时对于样品中的物质很难区分时，可以用其它的检验方法分层镜检将样品用四氯化碳进行脱脂和比重分离之后，样品与其它物质的区分会更加容易对样品中 的有机物和无机物分层之后，需在常温下干燥后再进行镜检非蛋白氮一类的物质与原料的 很多外观性质很不一样，通过两者的特异性之间的观察，可以对样品中是否掺有非蛋白氮一 类的物质作出一个大概的判断反应剂镜检用反应剂和样品进行反应，非蛋白氮一类的物质的化学性质和样品不一样，通过此种方法可 以对样品中的非蛋白氮进行鉴别经过四氯化碳分层之后，再与反应剂反应是比较好的一种 方法而镜检时在样品中加一滴或数滴浓硫酸，观察样品与浓硫酸反应的情况是一种比较直 观的鉴别方法因为无论动物蛋白还是植物蛋白，其与浓硫酸的反应速度和产生的现象比较 明显染色镜检用染色剂对样品进行染色，使样品中的植物或动物细胞染成不同的颜色，而非蛋白氮一类的 物质则和样品的染色后的表现不同，通过此种方法使两者区分开来从而加以鉴别以下是比 较常用的染色方法：对植物细胞的染色方法：番红一一固绿染色法。
取适量脱胎（视样品脂肪多少而定，可以用 四氯化碳，也可以用丙酮，对于脂肪少的也可以不用脱脂）样品于烧杯中，用1%的番红水 溶液浸泡l〜3h水洗（去多余的染料）将样品涂在玻片上，稍晾干滴加0. 1%的固绿（溶 剂用95%乙醇）过15s后滴加95%的乙醇，冲去多余固绿染料待乙醇稍挥发后，加甘 油液（甘油:水= 1:1）浸润，加盖玻片用生物显微镜检查染色结果：细胞核，木质化细 胞壁呈鲜红色，纤维素细胞壁、细胞质呈绿色因为非蛋白氮没有细胞核、细胞质等结构， 所以只要能够较好的掌握染色技巧，其对比效果比较明显当然，不能从染色效果判断其一 定为非蛋白氮对动物细胞的染色方法：苏木精一一曙红对染法取适量的脱脂样品于烧杯中，加入埃利希 苏木精染色液浸泡3〜5min，水洗数次（用5min左右）将样品涂在玻片上，滴加氨水3〜 4s后立即满加水，洗1 min，稍晾一下，加0.2%曙红水溶液浸润3min，滴加95%的乙醇， 洗去多余曙红染料再稍晾一下，加甘油浸润，加盖玻片，用生物显微镜观察其染色的结 果为：细胞核呈蓝色，细胞质呈淡红色通过此种方法染色，一般能够很容易的区分样品和 非蛋白氮一类的物质为了能够更清晰的在显微镜下区分样品与杂质，也可采用以下方法（对于检验鱼粉一类的物 质比较有效）：先用四氯化碳或三氯甲烷对样品分层，除去无机物，必要时再用丙酮进行脱 脂，再取一定量的样品置入蒸馏水中，搅拌，除去溶于水的物质，再用60目或80目的样品 筛过滤，将样品放入50〜60°C的烘箱中进行烘干（时间不能过长，以保持样品原来的状态）， 然后在显微镜下进行检验或再对其进行处理后镜检。
在显微镜检中，只能对非蛋白氮作初步判断若要进一步的分析判断，还需进行定量分析检 验2、非蛋白氮定量分析原理：非蛋白氮主要包括以下五类：尿素及其衍生物类、氨态氮类、铵类、肽类及其衍生物、动物 粪便及其它废弃物类如果在原料中掺有氨态氮类、铵类和粪便比较容易判断（可采用硫酸 铜沉淀法加镜检），一般很少将肽类及其衍生物掺入其中，剩下比较难鉴别的就是尿素及其 衍生物尿素和尿素衍生物经过强酸或强碱水解为氨盐或氨和其它的物质，在强碱的条件下 可以蒸馏出氨气，原料中的蛋白质经过水解成氨基酸盐，氨基酸盐在强碱条件下稳定，从而 可将非蛋白氮和真蛋白氮进行分离，测定结果包括了铵态氮如硫酸铵材料与试剂（1） 材料：酒精喷灯，60ml玻璃消化试管，凯氏定氮蒸馏装置，真空泵，200 °C恒温干燥箱，酸 式滴定管25ml，锥形瓶150或250ml，容量瓶100ml（2） 试剂与溶液：6mol / 1的盐酸溶液：35-37%分析纯盐酸加等体积蒸馏水2%硼酸：2g溶于100ml蒸馏水40%氢氧化钠：分析纯氢氧化钠40g溶于100ml水0.05mol/l盐酸标准溶液（邻苯二甲酸氢钾法标定）：4.2ml盐酸，注入100ml蒸馏水中。
分析步骤1 .精确称取有代表性肠粘膜蛋白粉样品0.1000g，置于容积为60ml的试管底部（注意 样品勿沾在管壁上），加入30ml 6mol / l的盐酸溶液，抽真空，将试管在距试管口 l〜 2cm处用喷灯加热并封口将封好的试管置于干燥箱内，于110C下水解24h冷却后 打开试管，将水解液过滤至100ml容量瓶中，用蒸馏水反复多次冲洗试管和滤纸，然后定 容至刻度2 .用20ml移液管移取20ml样液移入半微量式定氮仪的反应室中，加入20ml 1:1的氢 氧化钠溶液蒸馏10 min，用加有两滴混合指示剂的20ml 2%硼酸吸收馏出液3 .用硼酸吸收氨后，立即用0.05mol/l盐酸标准溶液滴定，溶液由蓝绿色变为灰红色即为 终点结果计算处理：非蛋白氮的粗蛋白质计算公式：CP（%） = （ V1-V0 ） XCX0.07X6.25/ MV1样品所消耗的盐酸的体积（ml ） , V0同时作空白滴定消耗的盐酸的体积，M所称 样品的质量（g ）C盐酸标准溶液的摩尔浓度（mol/l ）注意：从理论上讲，在强酸或强碱和一定的温度（110C ）的条件下，尿素及其尿素聚合物一定 会水解，但不一定能够在24h内水解完全。
有人做了大量的试验，证明了缩二脲在24h内 的水解程度可达到50 %以上，尿素在同样的条件下的水解比率可达到90 %以上即使 水解不完全，如果样品中含有尿素衍生物，其数值V 1也会远远的大于V 0，通过此数值， 也可判定样品中是否掺有非蛋白氮。