第十节第十节一、一、引言引言二、二、蛋白质酶分蛋白质酶分别纯化的前处置别纯化的前处置三、蛋白质酶分别三、蛋白质酶分别与纯化与纯化四、层析技术四、层析技术五、电泳技术五、电泳技术六、离心技术六、离心技术四、层析技术四、层析技术 层析法也称色谱法，是层析法也称色谱法，是19061906年俄国植物学家年俄国植物学家Michael Michael TswettTswett发现并命名的他将植物叶子的色素经过装填发现并命名的他将植物叶子的色素经过装填有吸附剂的柱子，各种色素以不同的速率流动后构成有吸附剂的柱子，各种色素以不同的速率流动后构成不同的色带而被分开，由此得名为不同的色带而被分开，由此得名为“色谱法色谱法Chromatography)Chromatography)后来无色物质也可利用吸附柱层析分别后来无色物质也可利用吸附柱层析分别19441944年出现纸层析年出现纸层析以后层析法不断开展，相继出现薄层层析、气相层析、以后层析法不断开展，相继出现薄层层析、气相层析、高压液相层析、亲和层析、凝胶层析等高压液相层析、亲和层析、凝胶层析等一层析的分类一层析的分类 按层析的分别机理分类按层析的分别机理分类 排阻层析排阻层析(exclusion chromatography)离子交换层析离子交换层析(ion exchange chromatography)吸附层析吸附层析(absorption chromatography)分配层析分配层析(partition chromatography)亲和层析亲和层析(affinity chromatography)金属螯合层析金属螯合层析(metal chelating chromatography)疏水层析疏水层析(hydrophobic chromatography)反向层析反向层析(reverse phase chromatography)聚焦层析聚焦层析(focusing chromatography)灌注层析灌注层析(perfusion chromatography)二排阻层析二排阻层析 凝胶层析凝胶层析凡是利用生物大分子的相对分子质量差别进展层凡是利用生物大分子的相对分子质量差别进展层析分别的方法，均称之为排阻层析。
析分别的方法，均称之为排阻层析用于层析的分别介质称为排阻层析介质用于层析的分别介质称为排阻层析介质凝胶层析介质主要是以葡聚糖、琼脂糖、聚丙烯凝胶层析介质主要是以葡聚糖、琼脂糖、聚丙烯酰胺等为原料，经过特殊工艺合成的层析介质酰胺等为原料，经过特殊工艺合成的层析介质目前已成为生物化学、分子生物学和生物制药目前已成为生物化学、分子生物学和生物制药的研讨和消费中必不可少的分别介质的研讨和消费中必不可少的分别介质1、凝胶层析的特点及运用、凝胶层析的特点及运用 特点：设备简单、操作方便、样品回收特点：设备简单、操作方便、样品回收率高、实验反复性好、特别是不改动样率高、实验反复性好、特别是不改动样品生物学活性等优点品生物学活性等优点用途：蛋白质用途：蛋白质(包括酶包括酶)、核酸、多糖等生、核酸、多糖等生物分子的分别纯化，同时还运用于蛋白物分子的分别纯化，同时还运用于蛋白质分子量的测定、脱盐、样品浓缩等质分子量的测定、脱盐、样品浓缩等2、凝胶层析的原理、凝胶层析的原理凝胶层析的固定相是惰性的珠状凝胶颗粒，凝胶凝胶层析的固定相是惰性的珠状凝胶颗粒，凝胶颗粒的内部具有立体网状构造，构成很多孔穴颗粒的内部具有立体网状构造，构成很多孔穴。
概念排阻层析，分子筛层析：当生物大分子概念排阻层析，分子筛层析：当生物大分子经过装有凝胶颗粒的层析柱时，根据它们分子经过装有凝胶颗粒的层析柱时，根据它们分子大小不同而进展分别的技术大小不同而进展分别的技术原理：凝胶颗粒内部具有多孔网状构造，被分别原理：凝胶颗粒内部具有多孔网状构造，被分别的混合物流过层析柱时，比凝胶孔径大的分子的混合物流过层析柱时，比凝胶孔径大的分子不能进入凝胶孔内，在凝胶颗粒之间的空隙向不能进入凝胶孔内，在凝胶颗粒之间的空隙向下挪动，并最先被洗脱出来；比网孔小的分子下挪动，并最先被洗脱出来；比网孔小的分子能不同程度的自在出入凝胶孔内外，在柱内经能不同程度的自在出入凝胶孔内外，在柱内经过的路程较长挪动速度较慢，最后被洗脱出来过的路程较长挪动速度较慢，最后被洗脱出来3.3.凝胶的种类和性质凝胶的种类和性质(1)(1)交联葡聚糖凝胶交联葡聚糖凝胶Sephadex)Sephadex)1)Sephadex G 1)Sephadex G G G 后的数字为凝胶吸水值的后的数字为凝胶吸水值的1010倍G G 反响凝胶的交联程度、膨胀程度和分部范围反响凝胶的交联程度、膨胀程度和分部范围。
2 2 SephadeX LH20 SephadeX LH20，是，是Sephadex G25Sephadex G25的羧丙基衍生物，溶于的羧丙基衍生物，溶于水和亲脂性溶剂，用于分别不溶于水的物质水和亲脂性溶剂，用于分别不溶于水的物质2)(2)琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶Sepharose;pharmacia;Bio-Gel(Blo-Rad)Sepharose;pharmacia;Bio-Gel(Blo-Rad)依托糖链之间的次级键维持网状构造，琼脂糖密度越大，网状构依托糖链之间的次级键维持网状构造，琼脂糖密度越大，网状构造越密集造越密集3)(3)聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺 一种人工合成的凝胶，以丙烯酰胺为单位，由甲叉双丙烯酰胺交联一种人工合成的凝胶，以丙烯酰胺为单位，由甲叉双丙烯酰胺交联而成交联剂越多，孔隙度越小交联剂越多，孔隙度越小商品名为生物胶商品名为生物胶PPBio-Gel P).Bio-Gel P).(4)(4)聚丙乙烯凝胶聚丙乙烯凝胶Styrogel)Styrogel)大网孔构造大网孔构造葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶(Sephadex)的物理特性的物理特性品 名干胶颗粒直径/m得水值Wf/g.g-1床体积/mL.g-1最适分段分离范围溶胀所需时间/h最大流体静力压/Pa(cmH2O)球蛋白分子质量Da线性葡聚糖分子质量/Da20lOOSephadex G-1O40-1201.00.12-3700700319810(100)Sephadex G-1540-1201.50.22.5-3.515001500319810(100)Sephadex G-25粗中粗细超细100-30050-15020-8010-402.50.24-61000-5000100-5000629810(100)Sephadex G-50粗中粗细超细100-30050-15020-8010-405.00.39-111500-30000500-10000629810(100)Sephadex G-75中粗超细40-12010-407.50.512-153000-700001000-500002434905(50)Sephdex G-100中粗超细40-12010-4010l.015-204000-1500001000-1000004853434(35)Sephadex G-150中粗超细40-12010-40151.520-305000-4000001000-1500007251472(15)Sephadex G-200中粗超细40-12010-40202.030-405000-8000001000-200000725981(10)4.层析柱的重要参数层析柱的重要参数 柱体积：柱体积是指凝胶装柱后，从柱体积：柱体积是指凝胶装柱后，从柱的底板到凝胶堆积外表的体积。
在色柱的底板到凝胶堆积外表的体积在色谱柱中充溢凝胶的部分称为凝胶床，因谱柱中充溢凝胶的部分称为凝胶床，因引柱体积又称引柱体积又称“床体积，常用床体积，常用Vt 表示外水体积：色谱柱内凝胶颗粒间隙，外水体积：色谱柱内凝胶颗粒间隙，这部分体积称外水体积，亦称间隙体积，这部分体积称外水体积，亦称间隙体积，常用常用Vo表示内水体积：由于凝胶为三维网状构造，颗粒内部内水体积：由于凝胶为三维网状构造，颗粒内部仍有空间，液体可进入颗粒内部，这就分间隙的总仍有空间，液体可进入颗粒内部，这就分间隙的总和为内水体积，又称定相体积，常用和为内水体积，又称定相体积，常用Vi表示不包不包括固体支持物的体积括固体支持物的体积Vg峰洗脱体积：是指被分别物质经过凝胶柱所需洗峰洗脱体积：是指被分别物质经过凝胶柱所需洗脱液的体积，常用脱液的体积，常用Ve 表示当运用样品的体积很少时，与洗脱体积比较可以当运用样品的体积很少时，与洗脱体积比较可以忽略不计，在洗脱图中，从加样到峰顶位置所用忽略不计，在洗脱图中，从加样到峰顶位置所用洗脱液体积为洗脱液体积为Ve当样品体积与洗脱体积比较不能当样品体积与洗脱体积比较不能忽略时，洗脱体积计算可以从样品体积的一半到峰忽略时，洗脱体积计算可以从样品体积的一半到峰顶位置。
当样品很大时，洗脱体积计算可以从运用顶位置当样品很大时，洗脱体积计算可以从运用样品开场到洗脱峰升高的弯曲点或半高处样品开场到洗脱峰升高的弯曲点或半高处洗脱体积洗脱体积5.5.凝胶过滤在实验室中的运用凝胶过滤在实验室中的运用1生物大分子物质的分别纯化2分子量的测定3分级分别4溶液浓缩5平衡常数的测定6细胞及颗粒的分别6.6.分子量的测定分子量的测定 蛋白质经过凝胶柱的速度即洗脱体积与其分子蛋白质经过凝胶柱的速度即洗脱体积与其分子量有关量有关:LogM=k1-k2VeLogM=k1-k2Ve VeVe为洗脱体积为洗脱体积先测得几种规范蛋白质的先测得几种规范蛋白质的VeVe，并以其分子量对数对，并以其分子量对数对VeVe作图得不断线，再测出作图得不断线，再测出待测样品的待测样品的VeVe，查规范曲，查规范曲线即可确定分子量线即可确定分子量LogMLogMA AB BC CLogMLogM测测V V测测三离子交换层析三离子交换层析 根据离子交换树脂对需求分别的各种离子的亲根据离子交换树脂对需求分别的各种离子的亲和力不同而到达分别的目的和力不同而到达分别的目的离子交换树脂通常是不溶于水的高分子物质，离子交换树脂通常是不溶于水的高分子物质，分子中含有可解离的基团。
分子中含有可解离的基团含有酸性可解离基团的称为阳离子交换树脂，含有酸性可解离基团的称为阳离子交换树脂，可解离出可解离出H+H+；含有碱性可解离基团的称为阴离子交换树脂，含有碱性可解离基团的称为阴离子交换树脂，可解离出可解离出OH-OH-1.离子交换层析的原理离子交换层析的原理 生物大分子如蛋白质、核酸等多价电解质有生物大分子如蛋白质、核酸等多价电解质有不同的分子大小及电荷陈列方式不同的分子大小及电荷陈列方式当在一定当在一定pHpH下净电荷为负的蛋白质分子可经下净电荷为负的蛋白质分子可经过静电键结合到带正电荷的阴离子交换剂上；过静电键结合到带正电荷的阴离子交换剂上；当在一定当在一定pHpH下净电荷为正的蛋白质分子可下净电荷为正的蛋白质分子可经过静电键结合到带负电荷的阳离子交换剂上；经过静电键结合到带负电荷的阳离子交换剂上；大分子依其与离子交换剂亲和力的不同，而大分子依其与离子交换剂亲和力的不同，而在以不同牢度被吸附于离子交换剂，经过改动在以不同牢度被吸附于离子交换剂，经过改动离子强度或离子强度或(和和)pH)pH使大分子再从离子交换剂上使大分子再从离子交换剂上先后被洗脱下来先后被洗脱下来。
2.离子交换层析的运用离子交换层析的运用1)1)水处置水处置 离子交换层析是一种简单而有效的杂质及各种离子离子交换层析是一种简单而有效的杂质及各种离子的方法，聚丙乙烯树脂广泛的运用于高纯水的制备、硬的方法，聚丙乙烯树脂广泛的运用于高纯水的制备、硬水软化以及污水处置等方面水软化以及污水处置等方面2)2)分别纯化小分子物质分别纯化小分子物质 离子交换层析广泛运用于无机离子、有机酸、核苷离子交换层析广泛运用于无机离子、有机酸、核苷酸、氨基酸、抗生素等小分子物质的分别纯化例如对酸、氨基酸、抗生素等小分子物质的分别纯化例如对氨基酸的分析运用强酸性阳离子聚苯乙烯树脂，将氨基氨基酸的分析运用强酸性阳离子聚苯乙烯树脂，将氨基酸混合液在酸混合液在pHpH值为值为2 23 3上柱这时氨基酸都结合在树脂上柱这时氨基酸都结合在树脂上，再逐渐提高洗脱液的离子强度和上，再逐渐提高洗脱液的离子强度和pHpH值，这样各种氨值，这样各种氨基酸将以不同的速度被洗脱下来，可以进展分别鉴定基酸将以不同的速度被洗脱下来，可以进展分别鉴定全自动氨基酸分析仪就是采用这种原理制成全自动氨基酸分析仪就是采用这种原理制成3)3)分别纯化生物大分子物质分别纯化生物大分子物质 离子交换层析是根据物质的带电性质的不同来进离子交换层析是根据物质的带电性质的不同来进展分别纯化的，是分别纯化蛋白质等生物大分子的一展分别纯化的，是分别纯化蛋白质等生物大分子的一种重要手段。
种重要手段由于生物样品的复杂性，普通很难只经过一次离由于生物样品的复杂性，普通很难只经过一次离子交换层析就到达高纯度，往往要与其它分别方法结子交换层析就到达高纯度，往往要与其它分别方法结合运用运用离子交换层析分别样品要充分利用其按带电运用离子交换层析分别样品要充分利用其按带电性质来分别的特性，只需选择适宜的条件，经过离子性质来分别的特性，只需选择适宜的条件，经过离子交换层析可以得到较称心的分别效果交换层析可以得到较称心的分别效果四吸附层析(absorption chromatography)吸附作用是指某些物质可以从溶液中将溶质浓吸附作用是指某些物质可以从溶液中将溶质浓集在其外表的景象集在其外表的景象利用吸附层析介质外表的活性分子或活性基团，利用吸附层析介质外表的活性分子或活性基团，对流动相中不同溶质产生吸附作用，利用其对对流动相中不同溶质产生吸附作用，利用其对不同溶质吸附才干的强弱而进展分别的一种方不同溶质吸附才干的强弱而进展分别的一种方法，称之为吸附层析法，称之为吸附层析固定相为固体，流动相为液体固定相为固体，流动相为液体物质之所以能在固体外表停留，这是由于固体外表的分物质之所以能在固体外表停留，这是由于固体外表的分子和固体内部分子所受的吸引力不同。
在固体内部，分子和固体内部分子所受的吸引力不同在固体内部，分子之间相互作用的力是对称的，其力场相互抵消而处子之间相互作用的力是对称的，其力场相互抵消而处于固体阐明的分子所收的力是不对称的，向内的一面遭于固体阐明的分子所收的力是不对称的，向内的一面遭到固体内部分子的作用力大，而外表层所受的作用力小，到固体内部分子的作用力大，而外表层所受的作用力小，因此气体或溶质分子在运动中遇到固体外表时遭到这种因此气体或溶质分子在运动中遇到固体外表时遭到这种剩余力的影响，就会被吸引而停留下来剩余力的影响，就会被吸引而停留下来吸附过程是可逆的，被吸附物在一定条件下可以解吸出吸附过程是可逆的，被吸附物在一定条件下可以解吸出来在单位时间内被吸附于吸附剂的某一外表积上的分来在单位时间内被吸附于吸附剂的某一外表积上的分子和同一单位时间内分开此外表的分子之间可以建立动子和同一单位时间内分开此外表的分子之间可以建立动态平衡，称为吸附平衡态平衡，称为吸附平衡吸附层析过程就是不断地产生平衡和不平衡、吸附与解吸附层析过程就是不断地产生平衡和不平衡、吸附与解吸的动态平衡过程吸的动态平衡过程实验中常用的固体吸附剂有氧化铝、硅酸镁、实验中常用的固体吸附剂有氧化铝、硅酸镁、磷酸钙、氢氧化钙、活性钙、蔗糖、纤维素和磷酸钙、氢氧化钙、活性钙、蔗糖、纤维素和淀粉。
淀粉常用的洗脱液有乙烷、苯乙醚、氯仿，以及乙常用的洗脱液有乙烷、苯乙醚、氯仿，以及乙醇、丙酮或水与有机溶剂构成的各种混合物醇、丙酮或水与有机溶剂构成的各种混合物吸附层析通常用于分别脂类、类固醇类、类胡吸附层析通常用于分别脂类、类固醇类、类胡罗卜素、叶绿素以及它们的前体等非极性和极罗卜素、叶绿素以及它们的前体等非极性和极性不强的有机物性不强的有机物五分配层析(partition chromatography)分配层析是利用混合物中各组分在两相中分配分配层析是利用混合物中各组分在两相中分配系数不同而到达分别目的的层析技术，相当于系数不同而到达分别目的的层析技术，相当于一种延续性的溶剂抽提方法一种延续性的溶剂抽提方法在分配层析中，固定相是极性溶剂例如水、在分配层析中，固定相是极性溶剂例如水、稀硫酸、甲醇等此类溶剂能和多孔的支持稀硫酸、甲醇等此类溶剂能和多孔的支持物物(常用的是吸附力小、反响性弱的惰性物质常用的是吸附力小、反响性弱的惰性物质如淀粉、纤维素粉，滤纸等如淀粉、纤维素粉，滤纸等)严密结合，使呈严密结合，使呈不流动形状；流动相那么是非极性的有机溶剂不流动形状；流动相那么是非极性的有机溶剂。
分配系数分配系数()()是指在一定温度和压力条是指在一定温度和压力条件下到达平衡，物质在固定相和流动相件下到达平衡，物质在固定相和流动相两部分的浓度比值两部分的浓度比值分配系数分配系数物质在固定相中的浓度物质在固定相中的浓度 物质在流动相中的浓度物质在流动相中的浓度 在层析过程中，当有机溶剂流动相流经样品点时，样在层析过程中，当有机溶剂流动相流经样品点时，样品中的溶质便按其分配系数部分地转入流动相向前挪品中的溶质便按其分配系数部分地转入流动相向前挪动当经过前方固定相时，流动相中的溶质就会进展动当经过前方固定相时，流动相中的溶质就会进展分配，一部分进入固定相经过这样不断进展的流动分配，一部分进入固定相经过这样不断进展的流动和再分配，溶质沿着流动方向不断前进各种溶质由和再分配，溶质沿着流动方向不断前进各种溶质由于分配系数不同，向前挪动的速度也各不一样分配于分配系数不同，向前挪动的速度也各不一样分配系数较大的物质，由于分配在固定相多些，分配在流系数较大的物质，由于分配在固定相多些，分配在流动相少些，溶质挪动较慢；而分配系数较小的物质，动相少些，溶质挪动较慢；而分配系数较小的物质，流动速度较快。
从而将分配系数不同的物质别分开来流动速度较快从而将分配系数不同的物质别分开来六亲和层析六亲和层析(Affinity Chromatography)许多物质都具有和某化合物发生特异性可逆结许多物质都具有和某化合物发生特异性可逆结合的特性例如：酶与辅酶或酶与底物产物合的特性例如：酶与辅酶或酶与底物产物或竞争性抑制剂等，抗原与抗体，凝集素与或竞争性抑制剂等，抗原与抗体，凝集素与受体，维生素与结合蛋白，凝集素与多糖或受体，维生素与结合蛋白，凝集素与多糖或糖蛋白、细胞外表受体，核酸与互补链或糖蛋白、细胞外表受体，核酸与互补链或组蛋白、核酸多聚酶、结合蛋白以及细胞与组蛋白、核酸多聚酶、结合蛋白以及细胞与细胞外表特异蛋白或凝集素等细胞外表特异蛋白或凝集素等1.亲和层析的原理 亲和层析法就是利用化学方法将可与待分别物亲和层析法就是利用化学方法将可与待分别物质可逆性特异结合的化合物称配体衔接到质可逆性特异结合的化合物称配体衔接到某种固相载体上，并将载有配体的固相载体装某种固相载体上，并将载有配体的固相载体装柱，当待提纯的生物大分子经过此层析柱时，柱，当待提纯的生物大分子经过此层析柱时，此生物大分子便与载体上的配体特异的结合而此生物大分子便与载体上的配体特异的结合而留在柱上，其他物质那么被冲洗出去。
然后再留在柱上，其他物质那么被冲洗出去然后再用适当方法使这种生物大分子从配体上分别并用适当方法使这种生物大分子从配体上分别并洗脱下来，从而到达分别提纯的目的洗脱下来，从而到达分别提纯的目的 配体配体蛋白质蛋白质蛋白质和配蛋白质和配体复合物体复合物交联试剂交联试剂载体载体配体配体载体与配体载体与配体交联体交联体杂质杂质杂质杂质游离配体游离配体2.亲和层析的特点 纯化效率极高：亲和层析由于配体与待纯化效率极高：亲和层析由于配体与待分别物质进展特异性结合，所以分别提分别物质进展特异性结合，所以分别提纯的效率极高，提纯度可达几千倍纯的效率极高，提纯度可达几千倍 3.亲和层析的运用 1 抗原和抗体抗原和抗体 利用抗原、抗体之间高特异的亲和力而进展分别的方利用抗原、抗体之间高特异的亲和力而进展分别的方法又称为免疫亲和层析例如将抗原结合于亲和层析法又称为免疫亲和层析例如将抗原结合于亲和层析基质上，就可以从血清中分别其对应的抗体基质上，就可以从血清中分别其对应的抗体抗原、抗体间亲和力普通比较强，其解离常数为抗原、抗体间亲和力普通比较强，其解离常数为108-1012 M，所以洗脱时是比较困难的，通常需求较剧，所以洗脱时是比较困难的，通常需求较剧烈的洗脱条件。
烈的洗脱条件2)激素和受体蛋白激素和受体蛋白 激素的受体蛋白属于膜蛋白，利用去污剂溶激素的受体蛋白属于膜蛋白，利用去污剂溶解后的膜蛋白往往具有类似的物理性质，难于解后的膜蛋白往往具有类似的物理性质，难于用通常的层析技术分别但去污剂溶解通常不用通常的层析技术分别但去污剂溶解通常不影响受体蛋白与其对应激素的结合所以利用影响受体蛋白与其对应激素的结合所以利用激素和受体蛋白间的高亲和力激素和受体蛋白间的高亲和力10-61012 M而进展亲和层析是分别受体蛋白的重要方而进展亲和层析是分别受体蛋白的重要方法目前曾经用亲和层析方法纯化出了大量的法目前曾经用亲和层析方法纯化出了大量的受体蛋白，如乙酰胆碱、肾上腺素、生长激素、受体蛋白，如乙酰胆碱、肾上腺素、生长激素、吗啡、胰岛素等等多种激素的受体吗啡、胰岛素等等多种激素的受体3)凝集素和糖蛋白凝集素和糖蛋白 凝集素是一类具有多种特性的糖蛋白，几乎都凝集素是一类具有多种特性的糖蛋白，几乎都是从植物中提取它们能识别特殊的糖，因此可是从植物中提取它们能识别特殊的糖，因此可以用于分别多糖、各种糖蛋白、免疫球蛋白、血以用于分别多糖、各种糖蛋白、免疫球蛋白、血清蛋白甚至完好的细胞。
清蛋白甚至完好的细胞用凝集素作为配体的亲和层析是分别糖蛋白的主要用凝集素作为配体的亲和层析是分别糖蛋白的主要方法伴刀豆球蛋白伴刀豆球蛋白A能结合含能结合含-D-吡喃甘露糖苷或吡喃甘露糖苷或-D-吡喃葡萄糖苷的糖蛋白吡喃葡萄糖苷的糖蛋白麦胚凝集素可以特异的与麦胚凝集素可以特异的与N-乙酰氨基葡萄糖或乙酰氨基葡萄糖或N-乙酰神经氨酸结合，可以用于血型糖蛋白乙酰神经氨酸结合，可以用于血型糖蛋白A、红细胞膜凝集素受体等的分别红细胞膜凝集素受体等的分别洗脱时只需用相应的单糖或类似物，就可以将待分洗脱时只需用相应的单糖或类似物，就可以将待分别的糖蛋白洗脱下来别的糖蛋白洗脱下来4多核苷酸和核酸多核苷酸和核酸 利用利用poly-U作为配体可以用于分别作为配体可以用于分别mRNA以及各种以及各种poly-U结合蛋白结合蛋白poly-A可以用于分别可以用于分别RNA聚合酶以及其它聚合酶以及其它poly-A结合蛋白结合蛋白以以DNA作为配体可以用于分别各种作为配体可以用于分别各种DNA结合蛋白、结合蛋白、DNA聚聚合酶、合酶、RNA聚合酶、核酸外切酶等多种酶类聚合酶、核酸外切酶等多种酶类5辅酶辅酶 核苷酸及其许多衍生物、各种维生素等是多种酶的辅酶核苷酸及其许多衍生物、各种维生素等是多种酶的辅酶或辅助因子，利用它们与对应酶的亲和力可以对多种酶或辅助因子，利用它们与对应酶的亲和力可以对多种酶类进展分别纯化。
类进展分别纯化例如固定的各种腺嘌呤核苷酸辅酶，包括例如固定的各种腺嘌呤核苷酸辅酶，包括AMP、cAMP、ADP、ATP、CoA、NAD+、NADP+等等运用很广泛，等等运用很广泛，可以用于分别各种激酶和脱氢酶可以用于分别各种激酶和脱氢酶6分别病毒、细胞分别病毒、细胞 利用配体与病毒、细胞外表受体的相互作用，利用配体与病毒、细胞外表受体的相互作用，亲和层析也可以用于病毒和细胞的分别亲和层析也可以用于病毒和细胞的分别利用凝集素、抗原、抗体等作为配体都可以用于利用凝集素、抗原、抗体等作为配体都可以用于细胞的分别细胞的分别例如各种凝集素可以用于分别红细胞以及例如各种凝集素可以用于分别红细胞以及各种淋巴细胞，胰岛素可以用于分别脂肪细胞各种淋巴细胞，胰岛素可以用于分别脂肪细胞等七金属螯合层析七金属螯合层析(metal chelating chromatography)利用固定相载体上偶联的亚胺基乙二酸为利用固定相载体上偶联的亚胺基乙二酸为配基与二价金属离子发生螯协作用，结配基与二价金属离子发生螯协作用，结合在固定相上，二价金属离子可以与流合在固定相上，二价金属离子可以与流动相中含有的半胱氨酸、组氨酸、咪唑动相中含有的半胱氨酸、组氨酸、咪唑及其类似物发生特异螯协作用而进展分及其类似物发生特异螯协作用而进展分别的方法，称之为金属螯合层析。
别的方法，称之为金属螯合层析金属螯合层析技术在现代基因工程中常用金属螯合层析技术在现代基因工程中常用于表达蛋白的分别于表达蛋白的分别NH2NH2NiHisHisHisHisprotein八高效液相色谱八高效液相色谱 HPLC 高效液相色谱法是以液体作为流动相，用颗粒高效液相色谱法是以液体作为流动相，用颗粒极细的高效固定相的柱色谱分别技术极细的高效固定相的柱色谱分别技术高效液相色谱对样品的适用性广，不受分析对高效液相色谱对样品的适用性广，不受分析对象挥发性和热稳定性的限制，因此弥补了气相象挥发性和热稳定性的限制，因此弥补了气相色谱法的缺乏色谱法的缺乏目前知的有机化合物中，可用气相色谱分析的目前知的有机化合物中，可用气相色谱分析的约占约占20%，而，而80%那么需用高效液相色谱来分那么需用高效液相色谱来分析1.高效液相色谱法的特点高效液相色谱法的特点特点：高压、高效、高速特点：高压、高效、高速 高沸点、热不稳定有机及生化试样高沸点、热不稳定有机及生化试样的高效分别分析方法的高效分别分析方法2.液相色谱仪、主要部件及流程液相色谱仪、主要部件及流程主要部件主要部件(1)高压输液泵高压输液泵主要部件之一，压力：主要部件之一，压力：150350105 Pa。
为了获得高柱效而运用粒为了获得高柱效而运用粒度 很 小 的 固 定 相 度 很 小 的 固 定 相 10m，液体的流动，液体的流动相高速经过时，将产生相高速经过时，将产生很高的压力，因此高压很高的压力，因此高压、高速是高效液相色谱、高速是高效液相色谱的特点之一的特点之一2)梯度淋洗安装梯度淋洗安装外梯度外梯度:利用两台高压输液泵，将两种不同极性的溶剂按一利用两台高压输液泵，将两种不同极性的溶剂按一定的比例送入梯度混合室，混合后进入色谱柱定的比例送入梯度混合室，混合后进入色谱柱内梯度内梯度:一台高压泵一台高压泵,经过比例调理阀经过比例调理阀,将两种或多种不同极性将两种或多种不同极性的溶剂按一定的比例抽入高压泵中混合的溶剂按一定的比例抽入高压泵中混合3)进样安装进样安装流路中为高压力任务形状，流路中为高压力任务形状，通常运用耐高压的六通阀进样安装，通常运用耐高压的六通阀进样安装，其构造如下图：其构造如下图：(4)高效分别柱高效分别柱柱体为直型不锈钢管，内径柱体为直型不锈钢管，内径16 mm，柱长，柱长540 cm开展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效开展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效5)高效液相色谱检测器高效液相色谱检测器紫外光度检测器紫外光度检测器UV：最小检丈量：最小检丈量10-9gmL-1，对流，对流量和温度的动摇不敏感，可用于梯度洗脱。
量和温度的动摇不敏感，可用于梯度洗脱最常用的检测器最常用的检测器光电二极管阵列检测器：光电二极管阵列检测器：1024个二极管阵列，各检测特个二极管阵列，各检测特定波长，计算机快速处置，三维立体谱图，如下图定波长，计算机快速处置，三维立体谱图，如下图3.影响分别的要素影响分别的要素 影响分别的主要要素有影响分别的主要要素有:固定相及分别柱；固定相及分别柱；流动相的流量、性质和极性流动相的流量、性质和极性;1固定相及分别柱固定相及分别柱选择适宜的固定相，降低填料粒度可显著提高柱效，但选择适宜的固定相，降低填料粒度可显著提高柱效，但在高效液相色谱中，分别柱的制备是一项技术要求非在高效液相色谱中，分别柱的制备是一项技术要求非常高的任务，普通很少自行制备常高的任务，普通很少自行制备选择短柱、细内径提高分析速度；选择短柱、细内径提高分析速度；研制高效柱填料是一活泼领域研制高效柱填料是一活泼领域2流动相及流动相的极性流动相及流动相的极性1可显著改动组分分别情况的流动相选择在液相可显著改动组分分别情况的流动相选择在液相色谱中显得特别重要色谱中显得特别重要液相色谱的流动相又称为液相色谱的流动相又称为：淋洗液，洗脱剂。
淋洗液，洗脱剂2亲水性固定液常采用疏水性流动相，即流动相亲水性固定液常采用疏水性流动相，即流动相的极性小于固定相的极性，称为正相液液色谱法的极性小于固定相的极性，称为正相液液色谱法，极性柱也称正相柱极性柱也称正相柱3假设流动相的极性大于固定液的极性，那么称假设流动相的极性大于固定液的极性，那么称为反相液液色谱，非极性柱也称为反相柱组分为反相液液色谱，非极性柱也称为反相柱组分在两种类型分别柱上的出峰顺序相反在两种类型分别柱上的出峰顺序相反流动相组成流动相组成流动相按组成不同可分为单组分和多组分；流动相按组成不同可分为单组分和多组分；按极性可分为极性、弱极性、非极性；按极性可分为极性、弱极性、非极性；按运用方式有固定组成淋洗和梯度淋洗按运用方式有固定组成淋洗和梯度淋洗常用溶剂常用溶剂:己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、水己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、水采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵敏调理流动采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵敏调理流动相的极性或添加选择性，以改良分别或调整出峰时间相的极性或添加选择性，以改良分别或调整出峰时间4.高效液相色谱法的主要分别类型高效液相色谱法的主要分别类型1 1吸附色谱液吸附色谱液-固吸附色谱固吸附色谱 以固体吸附剂为固定相，如硅胶、氧以固体吸附剂为固定相，如硅胶、氧化铝等，较常运用的是化铝等，较常运用的是5 510m10m的硅胶吸附剂的硅胶吸附剂。
流动相可以是各种不同极性的一元或多元溶流动相可以是各种不同极性的一元或多元溶剂2 2分配色谱液分配色谱液-液分配色谱液分配色谱 早期经过在担体上涂渍一薄层固定液早期经过在担体上涂渍一薄层固定液制备固定相制备固定相,现多为化学键合固定相，即用现多为化学键合固定相，即用化学反响的方法经过化学键将固定液结合在担化学反响的方法经过化学键将固定液结合在担体外表3 3离子交换色谱离子交换色谱 固定相为离子交换树脂，流动相为无机酸固定相为离子交换树脂，流动相为无机酸或无机碱的水溶液各种离子根据它们与树脂上的交或无机碱的水溶液各种离子根据它们与树脂上的交换基团的交换才干的不同而得到分别换基团的交换才干的不同而得到分别4 4凝胶色谱空间排阻色谱凝胶色谱空间排阻色谱 以凝胶为固定相凝胶是一种经过交联的、以凝胶为固定相凝胶是一种经过交联的、具有立体网状构造和不同孔径的多聚体的通称如葡具有立体网状构造和不同孔径的多聚体的通称如葡聚糖凝胶、琼脂糖等软质凝胶；多孔硅胶、聚苯乙烯聚糖凝胶、琼脂糖等软质凝胶；多孔硅胶、聚苯乙烯凝胶等硬质凝胶；凝胶等硬质凝胶；五、电泳技术 电泳的概念：带电物质在电场中向相反电极挪动的景电泳的概念：带电物质在电场中向相反电极挪动的景象称为电泳象称为电泳electrophoresiselectrophoresis。
电泳景象早在十九世纪初就已发现电泳景象早在十九世纪初就已发现18081808年俄国物理年俄国物理学家学家ReRessss进展了世界上第一次电泳实验但电泳技进展了世界上第一次电泳实验但电泳技术的广泛运用，那么是在术的广泛运用，那么是在19371937年用滤纸作为支持介质年用滤纸作为支持介质胜利地进展纸电泳以后，特别是近几十年以来，电泳胜利地进展纸电泳以后，特别是近几十年以来，电泳技术开展很快，各种类型的电泳技术相继诞生，在生技术开展很快，各种类型的电泳技术相继诞生，在生物化学、医学、免疫学等领域得到了广泛运用物化学、医学、免疫学等领域得到了广泛运用电泳技术开展简史 1809年俄国物理学家年俄国物理学家初次发现电泳景象初次发现电泳景象他在湿粘土中插上带玻璃管的正负两个电极，他在湿粘土中插上带玻璃管的正负两个电极，加电压后发现正极玻璃管中原有的水层变混浊，加电压后发现正极玻璃管中原有的水层变混浊，即带负电荷的粘土颗粒向正极挪动，这就是电即带负电荷的粘土颗粒向正极挪动，这就是电泳景象1909年年Michaelis初次将胶体离子在电场中的初次将胶体离子在电场中的挪动称为电泳他用不同挪动称为电泳他用不同pH的溶液在的溶液在U形管中形管中测定了转化酶和过氧化氢酶的电泳挪动和等电测定了转化酶和过氧化氢酶的电泳挪动和等电点。
点1937年瑞典年瑞典Uppsala大学的大学的Tiselius对电泳仪器作对电泳仪器作了改良，发明了了改良，发明了Tiselius电泳仪，建立了研讨蛋白质电泳仪，建立了研讨蛋白质的挪动界面电泳方法，并初次证明了血清是由白蛋白的挪动界面电泳方法，并初次证明了血清是由白蛋白及及、球蛋白组成的，由于球蛋白组成的，由于Tiselius在电泳技术在电泳技术方面作出的开辟性奉献而获得了方面作出的开辟性奉献而获得了1948年的诺贝尔化年的诺贝尔化学奖1948年年Wieland和和Fischer重新开展了以滤纸作重新开展了以滤纸作为支持介质的电泳方法，对氨基酸的分别进展过研讨为支持介质的电泳方法，对氨基酸的分别进展过研讨1950年年Durrum用纸电泳进展了各种蛋白质的分别用纸电泳进展了各种蛋白质的分别以后，开创了利用各种固体物质如各种滤纸、醋酸以后，开创了利用各种固体物质如各种滤纸、醋酸纤维素薄膜、琼脂凝胶、淀粉凝胶等作为支持介质纤维素薄膜、琼脂凝胶、淀粉凝胶等作为支持介质的区带电泳方法的区带电泳方法1959年年Raymond和和Weintraub利用人工合成的凝胶作为支利用人工合成的凝胶作为支持介质，创建了聚丙烯酰胺凝胶电泳，极大地提高了电泳持介质，创建了聚丙烯酰胺凝胶电泳，极大地提高了电泳技术的分辨率，开创了近代电泳的新时代。
技术的分辨率，开创了近代电泳的新时代50多年来，聚丙烯酰胺凝胶电泳仍是生物化学和分子生物多年来，聚丙烯酰胺凝胶电泳仍是生物化学和分子生物学中对蛋白质、多肽、核酸等生物大分子运用最普遍，分学中对蛋白质、多肽、核酸等生物大分子运用最普遍，分辨率最高的分析鉴定技术，是检验生化物质的最高纯度：辨率最高的分析鉴定技术，是检验生化物质的最高纯度：即即“电泳纯一维电泳一条带或二维电泳一个点的规电泳纯一维电泳一条带或二维电泳一个点的规范分析鉴定方法，至今仍被人们称为是对生物大分子进展范分析鉴定方法，至今仍被人们称为是对生物大分子进展分析鉴定的最后、最准确的手段，即分析鉴定的最后、最准确的手段，即“Last Check80年代开展起来的新的毛细管电泳技术，是化学和生化分年代开展起来的新的毛细管电泳技术，是化学和生化分析鉴定技术的重要新开展，己遭到人们的充分注重和运用析鉴定技术的重要新开展，己遭到人们的充分注重和运用一电泳的分类一电泳的分类原那么上按电泳的原理来分，可分为二类：原那么上按电泳的原理来分，可分为二类：自在界面电泳：又称挪动界面电泳，是指在没有支持介自在界面电泳：又称挪动界面电泳，是指在没有支持介质的溶液中进展的电泳。
其安装复杂，价钱昂贵，费质的溶液中进展的电泳其安装复杂，价钱昂贵，费时费力，不便于推行运用时费力，不便于推行运用区带电泳：是指有支持介质的电泳，待分别物质在支持区带电泳：是指有支持介质的电泳，待分别物质在支持介质上分别成假设干区带支持介质的作用主要是防介质上分别成假设干区带支持介质的作用主要是防止电泳过程中的对流和分散，以使被分别的成分得到止电泳过程中的对流和分散，以使被分别的成分得到最大分辨率的分别区带电泳由于采用的介质不同以最大分辨率的分别区带电泳由于采用的介质不同以及技术上的差别，又可分为不同的类型及技术上的差别，又可分为不同的类型按支持介质种类的不同，区带电泳可分为：按支持介质种类的不同，区带电泳可分为：纸电泳：用滤纸作为支持介质，多用于核苷纸电泳：用滤纸作为支持介质，多用于核苷酸的定性定量分析酸的定性定量分析醋酸纤维素薄膜电泳：医学上，常用于分析醋酸纤维素薄膜电泳：医学上，常用于分析血清蛋白、胎盘球蛋白，其优点是简便迅速，血清蛋白、胎盘球蛋白，其优点是简便迅速，便于保管照相，比纸电泳分辨率高便于保管照相，比纸电泳分辨率高以上二种类型的电泳，由于介质的孔径度大，以上二种类型的电泳，由于介质的孔径度大，没有分子筛效应，主要靠被分别物的电荷多少没有分子筛效应，主要靠被分别物的电荷多少进展分别。
进展分别淀粉凝胶电泳：多用于同工酶分析，凝胶铺厚些，可一淀粉凝胶电泳：多用于同工酶分析，凝胶铺厚些，可一层一层剥层分析一板多测天然淀粉经加工处置即层一层剥层分析一板多测天然淀粉经加工处置即可运用，但孔径度可调性差，并且由于其批号之间的质可运用，但孔径度可调性差，并且由于其批号之间的质量相差很大，很难得到反复的电泳结果，加之电泳时间量相差很大，很难得到反复的电泳结果，加之电泳时间长，操作费事，分辨率低，实验室中已很少运用长，操作费事，分辨率低，实验室中已很少运用琼脂糖凝胶电泳：普通用于核酸的分别分析琼脂糖凝琼脂糖凝胶电泳：普通用于核酸的分别分析琼脂糖凝胶孔径度较大，对大部分蛋白质只需很小的分子筛效应胶孔径度较大，对大部分蛋白质只需很小的分子筛效应聚丙烯酰胺凝胶电泳：可用于核酸和蛋白质的分别、纯聚丙烯酰胺凝胶电泳：可用于核酸和蛋白质的分别、纯化及检测其分辨率较高化及检测其分辨率较高聚丙烯酰胺和琼脂糖是目前实验室最常用的支持介质聚丙烯酰胺和琼脂糖是目前实验室最常用的支持介质二电泳的根本原理二电泳的根本原理 电泳是在电场的作用下而产生的物质运动，不电泳是在电场的作用下而产生的物质运动，不同的物质在一定的电场强度下，由于所带电荷同的物质在一定的电场强度下，由于所带电荷不同，因此遭到的引力不同，向相反电极泳动不同，因此遭到的引力不同，向相反电极泳动速度不同进而到达分别目的。
速度不同进而到达分别目的假设将带净电荷假设将带净电荷Q Q的粒子放入电场，那么该粒子所遭到的电荷引的粒子放入电场，那么该粒子所遭到的电荷引力为：力为：F F引引=E Q =E Q 1 1在溶液中在溶液中,运动粒子与溶液之间存在阻力运动粒子与溶液之间存在阻力F F阻阻 F F阻阻=6rV=6rV 当当F F引引=F=F阻时阻时 EQ=6rV EQ=6rV V =V =由上式可以看出由上式可以看出,粒子的挪动速度粒子的挪动速度(泳动速度泳动速度V)V)与电场强度与电场强度(E)(E)和粒子所带电荷量和粒子所带电荷量(Q)(Q)成正比成正比,而与粒子的半径而与粒子的半径(r)(r)及溶液的粘度及溶液的粘度()()成反比非球形分子如线状成反比非球形分子如线状DNADNA在电泳过程中遭到更大在电泳过程中遭到更大的阻力，即粒子的泳动速度与粒子外形有关的阻力，即粒子的泳动速度与粒子外形有关EQEQ6r6r234 由由4 4可知，带电粒子的泳动速度受电场强度影响，可知，带电粒子的泳动速度受电场强度影响，使得同一种带电粒子在不同电场里泳动速度不同使得同一种带电粒子在不同电场里泳动速度不同在一次电泳中，蛋白质处在同一电场中，为了便在一次电泳中，蛋白质处在同一电场中，为了便于比较，常用迁移率于比较，常用迁移率 m m或称泳动度，指带电粒子在或称泳动度，指带电粒子在单位电场强度下的泳动速度替代泳动速度表示粒子单位电场强度下的泳动速度替代泳动速度表示粒子的泳动情况。
的泳动情况m=V/E=Q/6r m=V/E=Q/6r 5 5 由上式可以看出，在同一电场中，迁移率仅与球形粒由上式可以看出，在同一电场中，迁移率仅与球形粒子所带电荷数量、粒子大小及溶液粘度有关，而与电子所带电荷数量、粒子大小及溶液粘度有关，而与电场强度无关场强度无关EQEQ6r6r4V=以上讨论的是在溶液中进展的自在界面电泳的情以上讨论的是在溶液中进展的自在界面电泳的情况，在用支持介质的区带电泳中，除上述影响要素外，况，在用支持介质的区带电泳中，除上述影响要素外，有效迁移率还受电渗是指在电场中，液体对于固体有效迁移率还受电渗是指在电场中，液体对于固体支持物的相对挪动的影响电泳时应防止用高电渗支持物的相对挪动的影响电泳时应防止用高电渗物质作支持介质物质作支持介质最后要思索选用离子强度适宜的溶液离子强度最后要思索选用离子强度适宜的溶液离子强度影响粒子的电动电势，溶液的离子强度越高，由于溶影响粒子的电动电势，溶液的离子强度越高，由于溶液中的离子会分担大部分电流，那么粒子的电动电势液中的离子会分担大部分电流，那么粒子的电动电势越小，泳动速度越慢，反之越快越小，泳动速度越慢，反之越快总之，电泳受粒子本身大小、外形、所带电量、总之，电泳受粒子本身大小、外形、所带电量、溶液粘度、温度、溶液粘度、温度、pHpH、电渗及离子强度多种要素的影、电渗及离子强度多种要素的影响。
响三聚丙烯酰胺凝胶电泳三聚丙烯酰胺凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种电泳方是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种电泳方法聚丙烯酰胺凝胶具有机械强度好，有弹性，透明，法聚丙烯酰胺凝胶具有机械强度好，有弹性，透明，化学性质稳定，对化学性质稳定，对pH和温度变化小，没有吸附和电渗作和温度变化小，没有吸附和电渗作用小的特点，是一种很好的电泳支持介质用小的特点，是一种很好的电泳支持介质聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体acrylamide，简称，简称Acr和交联剂和交联剂N，N-甲叉双丙烯酰胺甲叉双丙烯酰胺methylane bisacrylamide，简称，简称Bis在催化剂作用下合成的在催化剂作用下合成的聚丙烯酰胺凝胶电泳按原理和操作方式的不同，主要有不聚丙烯酰胺凝胶电泳按原理和操作方式的不同，主要有不延续聚丙烯酰胺凝胶电泳，延续聚丙烯酰胺凝胶电泳，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，聚丙烯酰胺凝胶电泳，聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳，双向电泳等类型聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳，双向电泳等类型。
CH2=CHC=ONH2丙烯酰胺丙烯酰胺N,N-甲叉甲叉双丙烯酰胺双丙烯酰胺CH2=CH C=O NH CH2 NH C=O CH2=CH聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺CH2-CHC=ONH2CH2-CH C=O NH CH2 NH C=O CH2-CHCH2 CHC=ONH2CH2-CHC=ONH2CH2-CHCH2-CHCH2-CHC=ONH2CH2-CHCH2-CH()n()n()m()m1.聚丙烯酰胺凝胶的制备聚丙烯酰胺凝胶的制备聚丙烯酰胺凝胶聚合为自在基聚合，其催化体系有两种：聚丙烯酰胺凝胶聚合为自在基聚合，其催化体系有两种：1.化学聚合化学聚合 化学聚合的催化剂引发剂通常采用过硫酸铵化学聚合的催化剂引发剂通常采用过硫酸铵ammonium persulfate，Ap，此外还需求加速剂，此外还需求加速剂TEMEDN，N，N，N-四甲基乙二胺，它能以自在四甲基乙二胺，它能以自在基的方式存在微量基的方式存在微量TEMED的参与，可促使过硫酸铵构的参与，可促使过硫酸铵构成自在基：成自在基：S2O82-2SO4-这些自在基的产生可引发丙烯酰胺与甲叉双丙烯酰胺的聚这些自在基的产生可引发丙烯酰胺与甲叉双丙烯酰胺的聚合、交联反响，构成有一定平均孔径的聚丙烯酰胺。
合、交联反响，构成有一定平均孔径的聚丙烯酰胺2.2.光聚合光聚合 光聚合通常用核黄素为催化剂，核黄素经光照构光聚合通常用核黄素为催化剂，核黄素经光照构成无色基，再被痕量氧氧化构成自在基，引发聚合反成无色基，再被痕量氧氧化构成自在基，引发聚合反响TEMEDTEMED的存在，可以加速聚合的存在，可以加速聚合上述聚合反响受许多要素的影响：上述聚合反响受许多要素的影响：1 1大气氧能淬灭自在基，阻止多聚体链长的添加大气氧能淬灭自在基，阻止多聚体链长的添加在进展化学聚合前，普通用减压抽气的方法除去溶液在进展化学聚合前，普通用减压抽气的方法除去溶液中溶解的空气在胶液外表，往往覆盖一层水或溶液，中溶解的空气在胶液外表，往往覆盖一层水或溶液，隔绝空气，可加速聚合隔绝空气，可加速聚合2 2低温、低低温、低pHpH都会减慢聚合反响速度都会减慢聚合反响速度3 3有些资料如聚丙烯酸甲酯有机玻璃，一些金属等有些资料如聚丙烯酸甲酯有机玻璃，一些金属等可抑制聚合反响可抑制聚合反响2.凝胶浓度和交联度与孔径大小的关系凝胶浓度和交联度与孔径大小的关系凝胶的物理性质如机械强度、弹性、透明度和粘着度都凝胶的物理性质如机械强度、弹性、透明度和粘着度都取决于凝胶总浓度取决于凝胶总浓度T和和Acr与与Bis两者之比。
凝胶总两者之比凝胶总浓度浓度T和交联度和交联度C的计算公式分别为：的计算公式分别为：Acrg+BisgBisgX100%C=Acrg+BisgVmlX100%T=凝胶孔径大小，主要受凝胶浓度的影响凝胶浓度越大，凝胶孔径大小，主要受凝胶浓度的影响凝胶浓度越大，孔径越小凝胶浓度过大，胶硬而脆，易折断浓度过小，孔径越小凝胶浓度过大，胶硬而脆，易折断浓度过小，凝胶稀软，不易操作，也易断裂当凝胶浓度确定后，交凝胶稀软，不易操作，也易断裂当凝胶浓度确定后，交联度为联度为5%5%时，凝胶具有最小孔径，超越时，凝胶具有最小孔径，超越5%5%或低于或低于5%5%时凝胶时凝胶孔径都要增大孔径都要增大在浓度为在浓度为7.5%的凝胶中，大多数生物体内的蛋的凝胶中，大多数生物体内的蛋白质能得到称心的分别效果因此，把浓度为白质能得到称心的分别效果因此，把浓度为7.5%凝胶称为规范胶凝胶称为规范胶对于一个未知样品，常用对于一个未知样品，常用7.5%的规范胶或的规范胶或4%-10%的凝胶梯度来测试，而后选出适宜的凝胶的凝胶梯度来测试，而后选出适宜的凝胶浓度用于研讨大分子核酸的凝胶多为用于研讨大分子核酸的凝胶多为2.4%的大孔凝的大孔凝胶，此时凝胶太软，不易操作，可参与胶，此时凝胶太软，不易操作，可参与0.5%琼琼脂糖，或在脂糖，或在3%凝胶中参与凝胶中参与20%蔗糖以添加机蔗糖以添加机械强度而又不影响凝胶孔径大小。
械强度而又不影响凝胶孔径大小3.不延续聚丙烯酰胺凝胶电泳不延续聚丙烯酰胺凝胶电泳系统的不延续性表如今以下几个方面：系统的不延续性表如今以下几个方面：1凝胶由上、下两层凝胶组成，两层凝胶的孔径不凝胶由上、下两层凝胶组成，两层凝胶的孔径不同，上层为大孔径的浓缩胶同，上层为大孔径的浓缩胶23，下层为小，下层为小孔径的分别胶孔径的分别胶 5152缓冲液离子组成的不延续性主要是阴离子不同缓冲液离子组成的不延续性主要是阴离子不同Gly-,Cl-3凝胶的凝胶的pH不同电极缓冲液为不同电极缓冲液为pH8.3的的Tris-甘氨甘氨酸缓冲液，浓缩胶为酸缓冲液，浓缩胶为pH6.8的的Tris-HCl缓冲液，而分缓冲液，而分别胶为别胶为pH8.9 的的Tris-HCl缓冲液4在电场中构成不延续的电位梯度在电场中构成不延续的电位梯度在这样一个不延续的系统里，存在三种物理效应，在这样一个不延续的系统里，存在三种物理效应，即样品的浓缩效应，凝胶的分子筛效应和电荷效应，即样品的浓缩效应，凝胶的分子筛效。